面向数字液滴PCR荧光检测的图像处理方法研究

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数字液滴PCR(droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)技术是一项重要的核酸分子绝对定量技术,因其精度高、易操作、反应腔室间完全隔离的优势广泛应用于核酸检测中。在dd PCR核酸检测实验的液滴荧光图像中,液滴计数的准确性将直接决定核酸检测结果的准确性。然而,由于实验中的液滴数量多、尺寸小、荧光强度不均匀等问题的存在,导致液滴难以计数。为此,本文对dd PCR液滴荧光图像处理方法进行了研究,为dd PCR实验提供了可靠的液滴计数结果。为获得高清晰度的dd PCR全局液滴荧光图像,本文对液滴的生成以及图像的拍摄与拼接方法进行了研究。首先,基于阶梯乳化原理与软光刻工艺制造了一种多喷嘴式液滴生成芯片,实现了液滴的生成。然后,以图像边缘有重叠的扫掠拍摄方式获取局部液滴图像组,并使用改进SIFT算法对图像进行拼接,进而得到全局液滴图像。对图像中影响液滴计数精度的诸因素进行了分析,并针对潜在的负面影响提出了相应的预处理方案。首先,结合限制阈值的中值滤波和高斯滤波,去除了图像中的复杂混合噪声,提高了图像的信噪比。然后,使用高斯模糊图像差分法消除图像中的光照不均匀效应,研究了模糊标准差取值对光照不均匀效应去除效果的影响,进而提出最佳模糊标准差取值策略;另外,针对彩色液滴荧光图像,基于HSV通道分离法对该方法进行了改进,避免了图像的色彩信息失真。最后,通过图像对比度的线性增强,为后续的液滴计数实验奠定了高质量的图像基础。针对单通道荧光图像,提出了基于图像灰度遍历与微分分析的液滴计数方法。通过灰度遍历的方式,将图像在每个灰度阈值下进行二值化。基于液滴识别判据,计算并统计图像在每个灰度阈值下所识别出的液滴数量,对数据进行微分分析以得出液滴的实际数量。通过多组人类g DNA核酸定量实验,验证了该方法的平均准确率为99.67%,较当前主流方法提高了1.62%,可有效应用于dd PCR单通道荧光图像液滴计数。针对多通道荧光图像,提出了基于图像RGB通道分离差分的液滴分类方法,将多通道图像的液滴识别问题简化为单通道图像的液滴识别问题。再基于液滴的识别判据,通过Otsu阈值分割法对多种液滴进行计数,通过多组肺癌EGFR T790M基因突变检测实验,验证了该方法的平均准确率为99.06%,较当前主流方法提高了2.91%,可有效应用于dd PCR多通道荧光图像液滴计数。
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