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近年来随着人们对成体干细胞的研究越来越深入，发现其在组织再生和损伤修复领域发挥着非常重要的作用。牙髓干细胞作为存在于牙髓组织的一种成体干细胞，也是口腔生物学领域的研究热点。它具有很强的增殖能力，在体外经过适当的诱导又能向成骨/成牙、成脂、成神经等方向分化。同时众多的研究也发现移植到体内的牙髓干细胞能够形成牙髓牙本质复合体样结构。因此，牙髓干细胞成功体外分离为构建组织工程牙齿和牙髓损伤修复的研究提供了重大的契机。细菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌主要的致病因子。研究发现LPS能够与细胞表面特异性受体TLR4结合调控间充质干细胞的分化。而龋病致牙髓损伤时，脱矿牙本质能释放TGFβl等众多生长因子，促进牙髓干细胞向OBLC分化。而细菌及其毒性产物也会进入牙髓，接触刺激牙髓干细胞，那么细菌及其毒性产物如LPS是否影响牙髓干细胞增殖和定向分化能力？目前尚不清楚。为此，本课题在成功构建牙髓干细胞系的基础上，用LPS对牙髓干细胞进行适当的刺激，旨在探索其对牙髓干细胞增殖分化能力的影响。我们还初步分析了MAPK信号通路在LPS调控的牙髓干细胞分化过程中作用。我们的研究结果如下：1.牙髓干细胞的分离、培养和鉴定我们通过酶消化组织块法分离培养原代细胞，采用有限稀释法对得到的原代细胞进行纯化，获得相对较为纯化均一的牙髓干细胞系。然后，我们采用了一系列针对干细胞生物学特性的方法对获得的干细胞进行了鉴定。通过流式细胞仪对细胞的表型进行分析，同时对细胞多向分化能力的进行了检测，结果均符合公认的DPSCs的生物学特征，证明我们已经成功的构建了hDPSCs细胞系。2. LPS对人牙髓干细胞增殖能力的影响我们通过LPS刺激二维平面和三维立体培养的牙髓干细胞检测其对hDPSCs增殖能力的影响。不同浓度的LPS（0.01-10ug/ml）刺激二维平面培养的牙髓干细胞，MTT检测结果显示LPS在短时间的培养时间（1-5d）内对hDPSCs的增殖能力影响不大，7d时与无刺激因素的对照组相比，各刺激组均出现抑制的现象；而用1ug/mlLPS刺激复合在HA/TCP支架材料上三维立体培养的hDPSCs，电镜观察发现7d组与3d组比较细胞数目明显增多；而3d、7d分别将对照组与LPS刺激组相比细胞数目无显著差异，14d时LPS刺激组较对照组相比细胞数目明显减少。提示LPS长期刺激牙髓干细胞可能会抑制其增殖能力。3. LPS对人牙髓干细胞定向分化能力的影响首先，我们通过实时定量PCR检测在牙髓干细胞分化过程中TLR4及相关矿化基因表达情况，发现TLR4在牙髓干细胞表面表达，而且牙髓干细胞分化7天时表达达到最高峰，提示LPS特异性受体TLR4很可能在牙髓干细胞分化早期发挥重要作用。矿化基因DSPP、DMP1、ALP、 OPN在牙髓干细胞在分化过程中均有不同程度的升高。随后，我们分别通过实时定量PCR和茜素红染色分别检测LPS在牙髓干细胞分化过程中对矿化相关基因表达和矿化结节形成情况的影响，结果显示LPS能够显著的促进矿化相关基因DSPP、DMP1、ALP、 OPN的表达；同时LPS刺激也能促进牙髓干细胞矿化结节的形成。我们又通过电镜观察LPS对三维培养的牙髓干细胞胞外基质分泌情况的影响，发现LPS刺激能够促进牙髓干细胞分泌胞外基质及胶原纤维样结构的形成。以上结果证实LPS能够促进牙髓干细胞的定向分化为成牙本质样细胞。以上研究结果与体内牙髓损伤修复的过程类似，该部分的研究为探明牙髓损伤修复的机制提供了可靠的体外研究模型。4. MAPK信号通路在LPS调控的人牙髓干细胞定向分化过程中作用的研究为了探索牙髓损伤修复的分子机制，我们对MAPK信号通路在LPS调控的牙髓干细胞定向分化过程的作用也进行了初步的分析。通过茜素红矿化结节染色和实时定量PCR分析，我们发现同时阻断ERK1/2和p38MAPK信号通路后，LPS调控的牙髓干细胞矿化结节和矿化基因表达均发生明显的降低，而阻断JNK对两者的影响却不是很显著。另外，Westernblot检测结果也显示LPS能够活化p38、ERK1/2激酶，且酶的活性随着LPS作用时间的延长而明显增强。说明ERK1/2和p38MAPK信号通路参与了LPS对牙髓干细胞的定向分化过程的调控，并在其中发挥着正向调控的作用，而JNK信号通路可能不参与其中。这为探索牙髓损伤修复的机制研究奠定了一定的基础。综上所述，LPS对牙髓干细胞的增殖能力和定向分化能力均有不同程度的影响，进一步研究发现ERK1/2和p38MAPK信号通路参与LPS调控的牙髓干细胞分化过程，并在其中发挥着正向调控的作用。本项研究为牙髓损伤修复机制的研究提供了一定的基础，也为临床活髓保存治疗提供了一定的思路。