日本血吸虫病是由日本血吸虫感染引起的一种慢性、危害严重的人畜共患寄生虫病。血吸虫释放或分泌一些抗原分子进入宿主体内,这些分子直接暴露于宿主免疫系统,诱导和调节宿主的免疫应答。一些排泄分泌蛋白(excretory/secretory proteins,ESPs),包括早期童虫和其它不同发育阶段虫体差异表达的排泄分泌蛋白对血吸虫在终末宿主体内感染的建立和维持至关重要。研究日本血吸虫童虫和成虫不同发育阶段排泄分泌蛋白质的组成和变化,鉴定分析与日本血吸虫生长、发育、繁殖等相关的重要分子,将有助于理解血吸虫与宿主间的相互作用机制,有助于发现血吸虫免疫调节关键分子及血吸虫病的疫苗候选分子。1.日本血吸虫14d童虫排泄分泌蛋白质组分析日本血吸虫具有复杂的生活史,童虫是血吸虫在终末宿主体内的早期发育阶段,是疫苗介导保护性免疫的主要靶标。排泄分泌蛋白在宿主与寄生虫相互作用中扮演重要角色,而日本血吸虫童虫排泄分泌蛋白质组至今尚未有研究报道。本实验首次应用高效液相色谱法和串联质谱技术对日本血吸虫14d童虫排泄分泌蛋白质的组成进行分析鉴定,最终鉴定到713种蛋白。这些蛋白的理论分子量介于10kDa和70kDa之间,理论等电点介于3到13之间。生物信息学分析显示,鉴定到的童虫排泄分泌蛋白主要参与应激反应(如heat shock protein)、碳水化合物代谢(如glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、蛋白质降解(如protein disulfide isomerase)等,其中一些ESPs可能是与日本血吸虫早期童虫适应寄生生活,维持在终末宿主体内生存、发育等相关的重要分子。本研究有助于了解日本血吸虫童虫与宿主间的相互作用机制及血吸虫病疫苗候选分子的筛选。2.日本血吸虫童虫和成虫排泄分泌蛋白质组的比较分析童虫和成虫是日本血吸虫寄生于终末宿主体内的两个主要发育阶段虫体,它们具有不同的形态学和生物学特征。童虫和成虫期别差异表达的排泄分泌蛋白在血吸虫的感染建立和维持、发育和繁殖过程中发挥了不同的生物学功能。本实验首次应用iTRAQ和液质联用技术,完成了日本血吸虫14d童虫和42d成虫排泄分泌蛋白质组的比较分析,最终鉴定到298种差异蛋白。其中,童虫高表达蛋白有161个,包括hot shock proteins、glucose-6-phosphate isomerase、protein disulfide isomerase等,生物信息学分析显示这些蛋白主要参与应激反应、碳水化合物代谢和蛋白降解等过程;成虫高表达蛋白有137个,包括thioredoxin peroxidase、adenine phosphoribosyltransferase等,它们主要与免疫调节和嘌呤代谢等相关;另有31个蛋白在童虫和成虫间不具有显著性差异,如phosphoglycerate mutase等。该研究可为阐述童虫和成虫生理学上的差异,及理解这两个发育阶段虫体差异表达ESPs在血吸虫生长发育中的作用提供实验依据,同时也可为寻找有效的疫苗候选分子提供基础。3.日本血吸虫蛋白质二硫键异构酶SjPDI的克隆、表达及重组蛋白rSjPDI诱导抗血吸虫感染免疫保护效果的评价蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)为本研究排泄分泌蛋白组分析中鉴定到的一种日本血吸虫排泄分泌蛋白。本文应用PCR技术对SjPDI基因进行克隆,该基因具有1410bp的开放阅读框,编码469个氨基酸。构建了重组表达质粒pET-28a-SjPDI,并在BL21大肠杆菌中获得成功表达,得到相对分子质量约为55 kDa的可溶性重组蛋白rSjPDI。Western blotting分析显示,rSjPDI可以被日本血吸虫成虫蛋白免疫兔血清识别,日本血吸虫成虫蛋白和成虫排泄分泌蛋白可以被rSjPDI免疫小鼠血清识别,说明重组蛋白rSjPDI具有良好的免疫原性和抗原性,且SjPDI确实存在于日本血吸虫排泄分泌蛋白中。实时定量PCR分析表明SjPDI在各个检测的生长发育阶段虫体中均有表达,且在42天成虫和早期童虫体内呈高表达。免疫荧光试验结果显示,SjPDI主要定位于日本血吸虫表膜及实质组织内。生物学特性分析显示,重组蛋白rSjPDI具有蛋白异构和抗氧化等功能。ELISA实验表明rSjPDI可引起免疫小鼠产生高水平的特异性IgG抗体。在两批小鼠免疫保护实验中,与对照组相比,rSjPDI免疫组分别获得35.32%和26.19%的减虫率及33.17%和31.7%的肝脏虫卵减少率。本研究表明排泄分泌蛋白SjPDI在血吸虫生长发育过程中扮演着重要角色,为一种潜在的日本血吸虫病疫苗候选分子。4.日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶对LPS诱导的巨噬细胞活化的影响及其调节机制研究巨噬细胞在机体抗寄生虫感染中发挥重要的免疫调节作用,在促炎性和抗炎性反应中扮演重要角色。谷胱甘肽脱氢酶为本研究排泄分泌蛋白组分析中鉴定到的另一种重要的日本血吸虫排泄分泌蛋白。该蛋白含有GSTs结构域,与克氏锥虫Tc52免疫调节分子具有相同的结构位点。本实验首次对日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶进行克隆表达,分析该重组蛋白对RAW264.7巨噬细胞活化的影响及其潜在的免疫调节机制。结果表明,重组日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶可抑制LPS诱导的巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α,IL-1β和iNOS的表达,同时可增强巨噬细胞中microRNA-146a分子的表达水平。进一步分析显示,miR-146a对LPS活化的巨噬细胞IL-1β的表达有负调控作用,miR-146a可能参与调节巨噬细胞促炎性免疫应答反应。本研究表明重组日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶可以通过影响巨噬细胞活化和促炎性反应参与宿主免疫应答进程,该分子可能在血吸虫的生存和发育中具有重要作用。综上,本研究应用高效液相色谱法和串联质谱法对日本血吸虫14d童虫排泄分泌蛋白组的组成进行分析鉴定,应用iTRAQ和液质联用技术对日本血吸虫14d童虫和42d成虫排泄分泌蛋白组进行比较分析。对日本血吸虫排泄分泌蛋白SjPDI的编码基因进行了克隆、表达及生物学特性研究,对重组蛋白rSjPDI诱导小鼠抗日本血吸虫感染的免疫保护效果进行评估。对日本血吸虫排泄分泌蛋白谷胱甘肽脱氢酶编码基因进行了克隆和表达,就该重组蛋白对RAW264.7巨噬细胞活化的影响及其潜在的免疫调节机制进行了初步分析。本研究有助于更好的了解血吸虫生长发育机制及血吸虫与宿主之间的相互作用机制,并可为筛选有效的疫苗候选分子提供实验依据。