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流行病学调查发现，绝经后妇女阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的发病率明显升高，AD是一种慢性中枢神经系统退行性疾病，其临床症状为进行性认知功能减退。研究表明，β淀粉样蛋白（Aβ）导致的细胞凋亡是AD神经元丢失及某些临床病理表现的主要原因之一，目前AD无特效治疗方法。雌激素可以抑制Aβ诱导神经元凋亡，可以降低患AD的风险，改善认知功能，有望成为妇女AD治疗的药物之一。但是，雌激素替代治疗所具有的潜在致癌危险，如子宫内膜癌和乳腺癌，限制了它的临床应用。研究发现，植物雌激素（phytoestrogen,PE）是一种来源于天然植物，其化学结构与雌二醇相似，具有雌激素样和抗雌激素样双重作用。植物雌激素可减轻妇女绝经综合症，对骨质疏松和心血管疾病具有预防和治疗作用，却不具有上述雌激素的副反应，必将成为未来雌激素替代治疗的新药物。植物雌激素能否与雌二醇一样，对中枢神经细胞产生保护作用，用于预防和治疗AD呢?它作用的机理如何?这正是本研究的目的，我们选用了植物雌激素中生物活性最大、含量最丰富的一种即染料木黄酮（Genistein,GST）作为研究药物，评价植物雌激素 第四军医大学博士学位论文对神经细胞保护作用的药效，旨在寻求药物治疗的新靶点。 本研究首先建立去卵巢大鼠动物模型，观察雌激素缺乏对大鼠行为学及脑神经递质和形态学方面的改变，及替代治疗对这些变化的影响;其次，用Ap:535诱导PC12细胞建立模拟日淀粉样蛋白沉积的AD细胞模型，研究Ap致神经细胞损伤的胞内机制，观察植物雌激素拮抗Ap诱导凋亡的机制。1.从整体水平观察GST对去卵巢大鼠学习记忆的影响及可能的机制 选用雌性SD大鼠切除卵巢模拟绝经妇女雌激素缺乏的病理生理改变。随机分为5组:假去势组（Sham组），OVX组，OVX+17旦一雌二醇组（E:组），OVX+GST-h组（GST高剂量组），OVX+GS下L组（GST低剂量组）。连续用药6周;根据多项指标，用以评价植物雌激素的活性。结果显示:（l）大鼠切除卵巢致雌激素缺乏，导致学习记忆下降，MQrris水迷宫检测提示逃避潜伏期及记忆频度较Sham组明显延长，大脑皮层和海马组织AchE活性、海马组织MAO和MDA较Sham组升高，海马组织SOD的活性较Sham组下降，比较有显著差异，补充GST或EZ能使上述结果逆转。（2）底物裂解法检测Caspase一3活性结果，OVX组海马组织CasPase一3活性增加，同时海马组织和皮层存在大量TUNEL阳性细胞;补充GST或EZ后，使海马组织CasPase一3活性降低，TUNEL阳性细胞比OVX组明显减少。（3） OvX组血EZ浓度较Shaln组降低，补充高剂量GST对血EZ浓度、子宫指数及子宫内膜均无影响;低剂量的GST能促进阴道上皮细胞角化及增加子宫指数，但对子宫内膜无影响。结论:GST和EZ有改善因OVX造成的大鼠学习记忆减退作用，其可能的机制是改善了胆碱能神经递质、胺能神经递质的代谢，具有抗氧化作用，调节凋亡蛋白的表达，抑制神经元凋亡。低剂量GST对生殖系统有微弱的雌激素样作用，但这种作用远远低于雌激素的影响，高剂量GST对生殖系统有明显的抑制作用。2.在细胞水平观察GST拮抗p一淀粉样蛋白诱导PC12凋亡的机制 （1）观察不同浓度的GST对PC12细胞的影响，采用MTT法、流式细胞检测仪、免疫组织化学法和RT-PCR法。结果显示，PC12细胞表达ERpmRNA和ERamRNA，但ERpmRNA表达较ERamRNA强， 第四军医大学博士学位论文10·9一10一m。l/L GsT促进细胞增殖，10一1 0-5 mol/L GsT抑制细胞增殖，在10一5 mol/L osT作用细胞出现凋亡峰，Iexl82。780能阻断GST或EZ的影响。结论:GST对神经细胞作用具有双重性，低浓度的雌激素样作用和高浓度的抗雌激素效应，通过雌激素受体发挥生物效应，这种作用能被雌激素受体阻断剂所阻断。 （2）观察不同浓度的Ap25f35作用于PC12细胞不同时间，采用M竹法、比色法、透射电镜及TUNEL检测。结果显示:5娜of/A p25一5能增加细胞存活率，随Ap:5一35浓度增加及时间延长PC12细胞活力逐渐下降，呈时间剂量依赖性。PC12细胞LDH活性在同一剂量作用下随时间延长而升高，细胞损伤也加重;透射电镜观测到20娜ol/A p 25一作用细胞48小时出现典型的凋亡特征。结论:A p25一35对PC12细胞影响具有双重性，低浓度的营养作用和高浓度的神经毒性，20林mol/Ap:5一作用细胞48小时可作AD细胞模型。 （3）观察了GST拮抗A日:5一诱导PC12凋亡的胞内机制，采用MTT法、比色法、免疫组织化学检测、Annexin V-FITC护I双标记流式细胞术及激光共聚焦显微术。结果显示，GST能改善A p 25.35诱导PC12细胞活力的降低，GST明显抑制Ap:5-35诱导PC12细胞LDH活力的升高，这两种作用可被ICll82。780所阻断;GST能阻止A p 25一诱导的细胞内钙离子的升高，抑制凋亡过程中关键酶CasPase一3的表达，减少细胞凋亡。结论:GST能从多环节拮抗A p25一5诱导细胞凋亡，特别是低浓度的GST通过提高PC12细胞的抗氧化损伤能力、降低细胞能钙超载，及调节凋亡相关基因的表达，而缓解由于A p 25-35神经毒性造成的钙平衡破坏、氧负荷及线粒体功能紊?