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脑胶质瘤(glioma)是一类起源于神经胶质细胞的肿瘤,是中枢神经系统最常见的肿瘤。近30年来,脑胶质瘤发生率以每年1%～2%的速率递增,恶性程度高,预后差。即使采用最强有力的综合治疗措施,患者的5年生存率仅为0.1%～8.9%。因此寻找新的更有效的治疗方案已经成为胶质瘤研究领域的重点。细胞周期进程失控是肿瘤发生发展的关键环节,而细胞周期依赖性激酶家族(cyclin-dependent kinase,CDKs)是细胞周期控制系统的核心。CDK2是CDK家族的重要成员,其在细胞周期调控的各个环节,如中心体复制、DNA合成、G1-S期过渡、G2期进展等过程中起着至关重要的作用。CDK2不仅是调控细胞周期进展和凋亡的限速酶,还是很多癌基因/抑癌基因的下游调控分子,因此CDK2异常表达导致的细胞周期失控可能在胶质瘤发展过程中起着十分重要的作用。非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)在生命过程中起着至关重要的作用,其功能可以延伸到胚胎发育,细胞增殖、分化、凋亡,基因印记,应激反应以及癌变等几乎所有的生物过程,其特点主要包括:①具有高度的组织细胞特异性和时序性,并且在疾病的不同区域和进程中都有特征性的表达组成模式。这提示我们,胶质瘤特异性ncRNA的异常表达有可能与CDK2活性失调关系密切。②调控关系复杂,每个ncRNA对应多个靶基因,而每个靶基因亦可被多个ncRNA调控。③调控机制多样,在染色质重塑、DNA序列、转录及转录后水平等多个层面作用于靶基因。这使得以ncRNA为媒介的基因表达调控网络异常复杂,有很多问题研究的不是很清楚。miRNA是一类长约22nt的ncRNA,其主要通过结合靶基因mRNA 3’UTR区,直接降解mRNA或阻碍其翻译,在转录后水平抑制基因的表达。然而miRNA的调控能力仍较为有限,其调控的蛋白表达量仅占全部蛋白的40%左右。另一类ncRNA是转录本长度超过200nt的长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)。随着分子遗传学和表观遗传学的发展,长链非编码RNA在神经系统相关疾病中的作用越来越引起人们的关注:其功能广泛而复杂,涉及到胚胎发育、基因印记、炎症应激、肿瘤等几乎所有的生物过程。在肿瘤和其他很多疾病中具有更加特征性的表达方式。由于lncRNA的调控机制多样,可以在多个层面作用于不同靶基因,这使得以lncRNA为媒介的基因表达调控网络异常复杂。目前研究发现miRNA和lncRNA在基因表达调控中并非孤立存在,而是存在着紧密的联系,两者之间的相互作用关系目前备受关注。特别是竞争性内源RNA(Competitive endogenous RNA,CeRNA)假说的提出,为阐明miRNA和1ncRNA的调控关系提供了新思路。201 1年,Pandolfi在cell杂志上首次提出:细胞内广泛存在ceRNA分子(mRNA、LncRNA、假基因等),其能够通过miRNA应答元件(MicroRNA Response Element,MRE)竞争结合相同的 miRNA,调节彼此的表达水平;如lncRNA就可以作为ceRNA分子竞争性的结合一个或多个miRNA,从而降低miRNA对下游靶基因的抑制作用,促进靶基因表达的“重新激活”。CeRNA假说的提出,代表了一种全新的基因表达调控模式。它将多种ncRNA(如miRNA,LncRNA)和mRNA整合在一个调控网络里。相比于miRNA调控网络,ceRNA涉及更多的RNA分子,调控网络更庞大,调控机制更为精细和复杂,能够从更深层面上挖掘基因功能和互联关系。但是,目前调控CDK2的ncRNA研究还仅仅只限于几个独立的miRNA,LncRNA或ceRNA的相关研究国内外尚未见报道。为寻找靶向调控CDK2的ceRNA网络。本实验主要研究了 LncRNA HSP90AA1-IT1通过竞争性结合miR-885-5p调控CDK2表达的具体作用机制。目的1、研究lncRNA HSP90AA1-IT1在脑胶质瘤的表达情况及流行病学特征。2、研究lncRNA HSP90AA1-IT1在脑胶质瘤细胞中的生物学作用。3、研究lncRNA HSP90AA1-IT1通过miR-885-5p调控CDK2表达的分子机制。方法第一部分:1、检测lncRNA HSP90AA1-IT1的组织表达水平利用qRT-PCR检测1ncRNA HSP90AA1-IT1在不同病理学分级的胶质瘤组织的表达水平。2、检测lncRNA HSP90AA1-IT1的流行病学特征通过随访病例资料,比较lncRNA HSP90AA1-IT1和各临床资料之间的关系,比较不同lncRNA HSP90AA1-IT1表达水平的患者的总生存时间。第二部分:1、建立敲除lncRNA HSP90AA1-IT1的胶质瘤细胞研究模型选择胶质瘤细胞系U251、U87MG胶质瘤细胞系,构建lncRNA HSP90AA1-IT1敲除慢病毒,感染细胞后筛选单克隆建立稳定细胞模型。2、研究lncRNA HSP90AA1-IT1对细胞增殖、迁移和凋亡等生物学功能的影响。2.1利用CCK8,EdU荧光染色和流式细胞技术,检测lncRNA HSP90AA1-IT1对细胞增殖和细胞周期进展的影响2.2利用Transwell小室培养实验观察lncRNA HSP90AA1-IT1和miR-885-5p对细胞侵袭迁移能力的影响2.3利用Annexin V-PI染色结合流式细胞技术检测lncRNA HSP90AA1-IT1或miR-885-5p对细胞凋亡程度的影响。2.4利用Western-blot技术检测lncRNA HSP90AA1-IT1对上皮间充质转换相关标志物表达的影响。第三部分:1、明确miR-885-5p和lncRNA HSP90AA1-IT1的相互作用关系1.1在miR-885-5p过表达稳定细胞模型中,利用qRT-PCR技术检测lncRNA HSP90AA1-IT1的表达变化;在lncRNA HSP90AA1-IT1敲除稳定细胞模型中,利用qRT-PCR技术检测miR-885-5p的表达变化。1.2构建lncRNA HSP90AA1-IT1荧光素酶报告基因质粒,转染miR-885-5p过表达细胞,双荧光素酶活性检测分析miR-885-5p对lncRNA HSP90AA1-IT1的调控作用。1.3利用定位突变技术对lncRNA HSP90AA1-IT1片段上可能的miR-885-5p结合位点进行突变,重复上述实验,确定miR-885-5p靶向调控lncRNA HSP90AA1-IT1的作用位点。2、研究miR-885-5p调控CDK2表达的分子机制2.1在miR-885-5p过表达的细胞模型中,利用qRT-PCR和western blot技术检测CDK2的表达变化。2.2构建CDK2 mRNA3’UTR-荧光素酶报告基因质粒,转染miR-885-5p过表达或敲除的稳定细胞模型,双荧光素酶活性检测分析miR-885-5p对CDK2的调控作用。2.3利用定位突变技术对CDK2 mRNA3’UTR可能的miR-885-5p结合位点进行突变,重复上述实验,确定miR-885-5p靶向调控CDK2的作用位点。3、探讨lncRNA HSP90AA1-IT1是否通过竞争性结合miR-885-5p调控CDK2的表达3.1在lncRNA HSP90AA1-IT1过表达或敲除的稳定细胞模型中,利用qRT-PCR和western blot技术检测CDK2的表达水平。3.2在lncRNA HSP90AA1-IT1过表达的稳定细胞模型中,转染miR-885-5p的真核表达载体;或者在lncRNA HSP90AA1-IT1敲除的稳定细胞模型中,转染miR-885-5p的基因沉默载体,对比上一步骤实验,观察CDK2的表达是否得到逆转。4、通过建立裸鼠成瘤模型,通过体内实验验证上述结果。结果第一部分:LncRNA HSP90AA1-IT1在胶质瘤表达升高且提示预后不良1、检测lncRNA HSP90AA1-IT1的组织表达水平qRT-PCR结果显示,相比于瘤旁和正常脑组织,LncRNA HSP90AA1-IT1在脑胶质瘤组织的表达明显增高。2、检测lncRNA HSP90AA1-IT1的流行病学特征LncRNA HSP90AA1-IT1表达与Ki-67表达及胶质瘤WHO分级具有相关性,且其高表达提示患者预后不良。第二部分:lncRNA HSP90AA1-IT1促进胶质瘤增殖、迁移和上皮间充质转换,抑制胶质瘤细胞凋亡1、建立敲除lncRNA HSP90AA1-IT1的胶质瘤细胞研究模型通过慢病毒感染建立1ncRNA HSP90AA1-IT1敲除细胞系后,qRT-PCR结果显示相比对照组,LncRNA HSP90AA1-IT1的表达显著降低。2、研究lncRNA HSP90AA1对细胞增殖、迁移和凋亡等生物学功能的影响2.1 CCK8,EdU荧光染色和流式细胞术分析显示,降低lncRNA HSP90AA1-IT1的表达可以显著抑制胶质瘤细胞增殖,并使细胞周期阻滞于G1期。2.2 Transwell小室培养实验显示,降低lncRNA HSP90AA1-IT1表达可以显著抑制胶质瘤细胞侵袭迁移能力。2.3利用Annexin V-PI染色结合流式细胞术显示,降低lncRNA HSP90AA1-IT1表达促进胶质瘤细胞凋亡。2.4 Western blot结果显示lncRNA HSP90AA1-IT1促进上皮间充质转换。第三部分:LncRNA HSP90AA1-IT1通过竞争性结合miR-885-5p调控CDK2的表达1、研究miR-885-5p和1ncRNA HSP90AA1-IT1的相互作用关系1.1 qRT-PCR和western blot实验显示,miR-885-5p与lncRNA HSP90AA1-IT1 的表达具有相关性。1.2荧光素酶报告基因实验显示,miR-885-5p通过与CDK2结合抑制其表达。2、研究miR-885-5p调控CDK2表达的分子机制2.1 qRT-PCR和western blot实验显示,过表达miR-885-5p可抑制CDK2的表达。2.2荧光素酶报告基因实验显示,miR-885-5p通过与CDK2结合抑制其表达。3、研究lncRNA HSP90AA1-IT1是否通过竞争性结合miR-885-5p调控CDK2的表达。3.1 LncRNA HSP90AA1-IT1 与CDK2的表达正相关。3.2 LncRNA HSP90AA1-IT1通过竞争性结合miR-885-5p调控CDK2的表达。4、动物实验结果与体外实验一致。结论1、在原发性胶质瘤样本中,LncRNA HSP90AA1-IT1表达显著上调,且与预后负相关。2、LncRNA HSP90AA1-IT1高表达可以促进胶质瘤细胞的增殖、迁移,抑制细胞凋亡3、LncRNA HSP90AA1-IT1 与miR-885-5p表达负相关,且lncRNA HSP90AA1-IT1 高表达会减弱miR-885-5p的抑癌作用。4、LncRNA HSP90AA1-IT1通过miR-885-5p调控CDK2的表达。