食管癌是世界上高恶性度的肿瘤之一,其肿瘤发病率排名第八,肿瘤相关病死率排名第六。全世界每年大约有450000人患食管癌,尤其在南美洲和亚洲地区,特别是日本和中国,有较高的发病率。食管癌的局部侵润和远处转移是引发该病死亡率的主要原因。由于该病不易发现,多数患者在临床确诊时,肿瘤已无法切除,或可见远端转移灶,无法采用手术治疗,因此该病发病率接近死亡率,其5年生存率也较低,约为15%。在中国和其他的亚洲国家,食管鳞状细胞癌是最普遍的病理类型。尽管随着科学的发展,手术、放疗和化疗有了很大的进步,但对于提高食管癌患者总体生存率方面并没有明显的效果,因此期待新的治疗策略。目前,肿瘤免疫治疗已经成为肿瘤治疗的新趋势,是继手术、化疗和放疗后的又一种肿瘤治疗模式。该方法创伤小、针对性强,尤其对于手术疗效不佳的肿瘤,可能成为一种较好的选择。识别高效特异的靶抗原是肿瘤免疫治疗的关键一步。高效特异性肿瘤抗原必须在肿瘤组织中高表达,且在正常组织中无表达,即表达具有高度限制性,才能避免肿瘤免疫治疗过程中发生自身免疫性疾病。癌睾丸抗原(CTA),因其特异性表达模式成为肿瘤免疫治疗的理想靶点,其广泛表达于各种肿瘤组织中,而在正常组织中仅表达于睾丸生殖细胞,偶而也表达于胎盘组织。由于睾丸是免疫豁免器官,不表达人类白细胞抗原(HLA)分子,不会引起机体特异性免疫反应。因此CTA作为特异性肿瘤免疫治疗的靶点,有很好的应用前景。黑色素瘤抗原基因(Melanoma-associated antigen gene,MAGE),是CTA家族成员,是从黑色素瘤细胞中分离出来的一个大家族抗原基因。近年来,导师所在课题组一直致力于研究MAGE家族的生物学功能及其作为肿瘤特异性免疫治疗靶分子的可能性。根据MAGE的表达模式,MAGE家族分为两个亚类,即MAGE-Ⅰ类抗原和MAGE-Ⅱ类抗原。其中MAGE-Ⅰ类抗原为肿瘤特异性抗原,在正常体细胞不表达或很少表达;MAGE-Ⅱ类抗原在正常成人体细胞中均有表达,因此不属于CTA的范畴。MAGE-Ⅰ类抗原又分为三个亚类,即MAGE-A、MAGE-B和MAGE-C。其中MAGE-A包括12个成员,即MAGE-A1~MAGE-A12。目前关于MAGE-A亚型基因在食管癌中的表达和调节及其在食管癌细胞中生物学功能的研究还很少。因此本研究首先采用了PCR及酶切的方法研究了MAGE-A亚型在5种食管鳞状细胞癌细胞系的基因表达谱,探讨了MAGE-A亚型在食管癌细胞中表达的特点和模式;通过去甲基化试剂地西他滨的作用,测定食管癌肿瘤细胞的活性、细胞迁移能力、细胞侵袭能力、细胞周期变化,及侵袭相关蛋白和信号通路蛋白的表达变化,研究了地西他滨对食管癌肿瘤细胞MAGE-A表达谱的调节作用,及其对肿瘤细胞增殖和侵袭能力的影响;利用si RNA技术沉默Eca109和KYSE170细胞中的MAGE-A基因,研究了MAGE-A基因在食管癌肿瘤细胞中的生物学功能,即对肿瘤细胞增殖活性、迁移侵袭能力和侵袭相关蛋白分子、信号通路蛋白表达的变化;探讨了MAGE-A在食管癌肿瘤细胞中的生物学作用及其机制。主要研究内容和结果如下:第一部分五种食管鳞状细胞癌细胞MAGE-A亚型基因表达谱目的:检测5种食管鳞状细胞癌细胞系(Eca109、KYSE170、TE1、TE10、TE13)中MAGE-A1,A2,A3,A4,A6,A8,A9,A10,A11的基因表达情况。方法:对于MAGE-A8,A9,A10,A11,采用单独设计引物进行普通PCR进行基因表达鉴定;对于MAGE-A1,A2,A3,A4,A6采用巢式PCR扩增共同片段,并利用扩增片段内不同限制性内切酶位点进行酶切产生大小不同的片段进行MAGE-A亚型进行表达鉴定。结果1五种食管鳞状细胞癌细胞系(Eca109、KYSE170、TE1、TE10、TE13),每种至少表达二种MAGE-A亚型基因。2五种食管鳞状细胞癌细胞系(Eca109、KYSE170、TE1、TE10、TE13),MAGE-A亚型的表达呈多重表达特征。3五种食管鳞状细胞癌细胞系(Eca109、KYSE170、TE1、TE10、TE13)表现为异质性,其MAGE-A亚型的表达各不相同。4五种食管鳞状细胞癌细胞系(Eca109、KYSE170、TE1、TE10、TE13)中,MAGE-A2表达率为80%;MAGE-A3为40%;MAGE-A8为20%;MAGE-A9为100%;MAGE-A10为80%;MAGE-A11为40%。结论1 MAGE-A亚型在食管鳞状细胞癌细胞系中有较高表达率。2 MAGE-A亚型在食管鳞状细胞癌细胞系中表达呈多重性,食管癌肿瘤细胞表现为异质性。3 MAGE-A2、MAGE-A9、MAGE-A10表达率较高,分别为80%、100%和80%。提示:这些分子可作为食管癌肿瘤免疫治疗的共同靶点,有利于提高免疫治疗效果。第二部分地西他滨对MAGE-A表达的调节及其对肿瘤细胞功能的影响目的:检测地西他滨对食管癌肿瘤细胞Eca109中MAGE-A1,A2,A3,A4,A6,A8,A9,A10,A11基因表达的调节作用;同时测定低浓度地西他滨对Eca109细胞增殖、迁移侵袭及细胞周期的影响。方法:对于MAGE-A8,A9,A10,A11,采用单独设计引物进行普通PCR进行基因表达鉴定;对于MAGE-A1,A2,A3,A4,A6采用巢式PCR扩增共同片段,并利用扩增片段内不同限制性内切酶位点进行酶切,产生的大小不同片段可进行MAGE-A亚型基因表达的鉴定。低浓度地西他滨处理后,利用MTT方法测定肿瘤细胞增殖能力;利用细胞划痕实验测定细胞迁移能力;利用侵袭小室实验测定细胞侵袭能力;利用细胞流式分析技术测定肿瘤细胞周期变化;利用蛋白印迹技术检测地西他滨处理后肿瘤细胞侵袭相关蛋白MMP2和信号通路蛋白NF-kB的表达情况。结果1地西他滨调节MAGE-A亚家族成员在食管癌细胞Eca109的基因表达。Eca109细胞中,MAGE-A亚型基础表达谱为MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A9、MAGE-A10。0.5mM地西他滨药物处理后,诱导表达了MAGE-A8和MAGE-A4,而MAGE-A9和MAGE-A10的表达出现了降低。2地西他滨抑制Eca109细胞增殖活性。地西他滨对细胞增殖活性的影响表现为时间依赖性和剂量依赖性。和对照组相比,地西他滨0.5mM处理24小时,细胞增殖活性开始降低;在0.5mM、2.5mM、5mM浓度下,处理组细胞增殖活性分别降低了15%、17.6%、18.2%,随浓度增高,细胞增殖抑制加强;72小时后,地西他滨组(0.5mM、2.5mM、5mM)细胞增殖活性分别降低18.18%(P<0.01)、24.64%(P<0.05)、40.13%(P<0.05)。3地西他滨抑制Eca109细胞的迁移。和对照组相比,0.5mM地西他滨处理组细胞迁移能力在6小时、12小时、24小时后,分别降低了39.1%(P<0.05)、31.7%(P<0.01)、34%(P<0.01)。4地西他滨抑制Eca109细胞的侵袭。和对照组相比,0.5mM地西他滨处理组48小时后,穿过Transwell小室的细胞数降低了47.2%(P<0.05)。5地西他滨诱导Eca109细胞周期G2/M期阻滞。和对照组相比,0.5mM地西他滨处理组,G2/M期的细胞数量占比增多(处理组:31.59±0.89;对照组:27.84±0.22)(P<0.05),而在S期细胞数量占比降低(处理组:25.68±0.83;对照组:32.03±1.73)(P<0.05);在G0/G1期细胞数量占比没有显著性的变化。6地西他滨降低了Eca109细胞NF-kB2和MMP2的表达。和对照组相比,0.5mM地西他滨处理组和1mM地西他滨处理组,NF-kB p-p100蛋白表达分别降低26.77%、36.78%(P<0.05);NF-kB p52蛋白表达降低了34.98%、50.63%(P<0.05);MMP2表达降低20%、24.26%(P<0.05)。结论1低剂量地西他滨能够抑制Eca109细胞增殖活性,同时低剂量地西他滨诱导了肿瘤细胞发生细胞周期G2/M期阻滞。提示:低剂量地西他滨诱导Eca109肿瘤细胞发生细胞周期阻滞,可能导致了肿瘤细胞增殖活性的降低。2低剂量地西他滨能够降低Eca109细胞迁移和侵袭的能力,同时处理组NF-kB2和MMP2蛋白表达降低。提示:低剂量地西他滨有可能通过降低Eca109细胞MMP2蛋白表达抑制肿瘤细胞迁移侵袭能力,而NF-kB2信号通路有可能参与了该过程。3低剂量地西他滨诱导Eca109细胞中MAGE-A8和MAGE-A4的表达,增加了MAGE-A亚型肿瘤免疫治疗抗原靶点。4低剂量地西他滨联合MAGE-A靶点免疫治疗晚期食管鳞状细胞癌,有可能成为晚期食管癌患者治疗的新策略。第三部分 MAGE-A 的生物学功能及其机制目的:检测MAGE-A在食管癌肿瘤细胞Eca109和KYSE170中,其对细胞增殖、迁移、侵袭的生物学功能影响,并探讨其作用机制。方法:选择含有针对MAGE-A亚家族保守基因的6种si RNA混合物,利用si RNA沉默技术,研究MAGE-A亚型的生物学功能。采用普通PCR测定MAGE-A8,A9,A10,A11的基因表达沉默效果,采用巢式PCR扩增共同片段测定MAGE-A1,A2,A3,A4,A6基因沉默效果;采用蛋白印迹测定MAGE-A亚型蛋白表达沉默效果。确定MAGE-A si RNA能有效沉默MAGE-A后,利用MTT方法测定肿瘤细胞增殖能力;利用细胞划痕实验测定细胞迁移能力;利用侵袭无胶小室和有胶小室实验测定细胞侵袭能力。利用蛋白印迹技术测定肿瘤细胞内MMP2蛋白和信号通路蛋白p-p38蛋白表达情况;采用p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580,检测p38信号通路是否参与了MAGE-A沉默后肿瘤细胞发生的生物学效应改变。结果1 MAGE-A si RNA能够抑制了MAGE-A亚型基因和蛋白表达。和对照组si-scramble相比,转染了50n M和100n M MAGE-A si RNA的Eca109和KYSE170细胞,其MAGE-A的m RNA和蛋白的表达均降低。转染100n M MAGE-A si-RNA的细胞组,MAGE-A亚型蛋白表达降低更明显。提示:实验采取100 n M转染si RNA。2沉默MAGE-A基因抑制食管癌细胞的增殖。和对照组相比,转染100n M MAGE-A si RNA 48小时后,Eca109和KYSE170细胞增殖活性,分别降低了11.26%(P<0.05)和12.61%(P<0.05)。3沉默MAGE-A基因抑制食管癌细胞迁移能力。和对照组相比,转染100n M MAGE-A si RNA后,0-24小时迁移能力分别降低了32.97%和41.15%(P<0.05)。4沉默MAGE-A基因抑制食管癌细胞的侵袭能力。和对照组相比,转染100n M MAGE-A si RNA后,两种肿瘤细胞的侵袭能力在无胶小室中降低了32%和44.55%(P<0.05);在有胶小室中降低了51.5%和39.48%(P<0.05)。5沉默MAGE-A基因抑制食管癌细胞中MMP2、c-Myc和p-p38的表达。转染100n M MAGE-A si RNA后,Eca109细胞的c-Myc、MMP2表第三部分MAGE-A的生物学功能及其机制达分别降低19.12%、61.11%(P<0.05);KYSE170细胞c-Myc表达降低了47.67%(P<0.05)。食管癌细胞Eca109和KYSE170中磷酸化p38水平均降低,分别降低了27.6%和39.45%(P<0.05),提示:P38 MAPK信号通路可能参与了MAGE-A基因沉默引发的肿瘤细胞生物学功能的改变,如细胞增殖活性降低和侵袭能力抑制;肿瘤细胞中MMP2或c-Myc分子可能是p38信号通路的效应分子。6用SB203580阻断p38MAPK信号通路途径抑制食管癌细胞侵袭能力、降低细胞MMP2、c-Myc的表达。和对照组相比,2mM SB203580处理48小时后,穿过基质胶包被小室的肿瘤细胞数量显著减少,侵袭能力分别降低了31.67%和28.2%(P<0.05);Eca109和KYSE170细胞中c-Myc的表达都出现了降低,分别降低了27.65%和28.2%(P<0.05);Eca109细胞中MMP2降低了19.3%(P<0.05)。SB203580处理组,P38信号通路蛋白p-p38和NF-kB2信号通路蛋白p100、p52表达没有显著性变化。提示:p38MAPK信号通路阻断后,细胞生物学效应的改变和沉默MAGE-A基因后效应改变相一致;肿瘤细胞中MMP2和c-Myc可能是p38MAPK信号通路的效应分子;沉默MAGE-A基因有可能通过p38MAPK信号通路途径,引发MMP2和c-Myc的降低,抑制了食管癌肿瘤细胞的侵袭能力。结论1沉默MAGE-A抑制食管癌细胞的增殖活性和迁移侵袭能力。2沉默MAGE-A抑制食管癌细胞c-Myc和MMP2的表达。3沉默MAGE-A抑制食管癌细胞p38 MAPK通路蛋白的表达。4在食管癌细胞中,p38MAPK信号通路部分参与了MAGE-A沉默后肿瘤细胞迁移侵袭能力降低的生物学过程。5沉默MAGE-A可能通过抑制食管癌细胞p38MAPK信号通路,降低表达了通路效应分子c-Myc和MMP2,从而抑制了食管癌细胞的增殖活性和迁移侵袭能力。