第一部分白喉毒素／人B细胞活化因子融合蛋白的诱导表达、鉴定及纯化研究背景靶向治疗的概念最早于1956年由德国化学家Ehrlich提出,当前在抗肿瘤药物研究中肿瘤靶向治疗因其特异性强、副作用少等优点而成为其中的重要研究领域,其主要作用机理是：将特异性的靶向载体与毒性物质通过一定方法连接起来,靶向载体定向将靶向治疗药物输送到肿瘤部位,毒性物质杀伤肿瘤细胞。毒性物质亦称为“弹头”,主要包括毒素、放射性同位素和化学药物等。肿瘤靶向治疗药物中的免疫毒素由于其载体靶向特异性高和毒素杀伤性强的特性使其成为肿瘤靶向治疗研究中的热点领域。上世纪80年代,有研究者根据靶向治疗的理念制造出了第一代免疫毒素,是利用化学偶联的方法将毒素蛋白通过二硫键或硫醚键偶联到与靶向载体上,在动物试验中显示了全身副作用低靶向杀伤力强的特性,常用的偶联剂有：N-琥珀酰亚胺基-3-[2-吡啶二硫基]-丙酸酯(SPDP)、N-羟基琥珀酰亚胺、S-乙酰巯基琥珀酸酐等。随着分子生物学技术的发展,研究者利用基因重组技术将靶向载体与毒素分子重组融合构建出重组免疫毒素,此即第二代免疫毒素。研究者还通过基因重组技术来改良毒素的特性,比如：去除毒素结构中的细胞结合域来降低其非特异性毒性,通过基因突变来提高其杀伤肿瘤细胞作用等。另一方面,根据靶抗原的多样性,研究者利用分子生物学技术构建出多样性的载体。从免疫原性和毒性两个方面进行改造,推动了免疫毒素研究的发展。构建免疫毒素的毒性分子种类很多,主要有以下几类：植物性毒素、细菌性毒素、人源性蛋白毒素、真菌性毒素等。构建免疫毒素常用的毒素分子之一白喉毒素(diphtheria toxin, DT)属于细菌性毒素,是白喉杆菌被p噬菌体溶源化后,由β噬菌体tox基因编码合成的外毒素,分子全长535aa,分子量为58330D,分为3个彼此独立的结构域：酶活性区(C区)、跨膜转运区(T区)和膜受体结合区(R区),便于拆分操作,为设计免疫毒素提供了有利条件。利用分子生物学技术对白喉毒素进行改造以适应构建免疫毒素的需要,比如采用截断的DT(如DT388. DAB389等),或者将DT分子中的T区去除或点突变,这样就制备出了一系列DT的衍生物或DT的突变体(如CRM9、 CRM107),他们大多保留了C区和T区,也就保留了酶活性和跨膜转运的功能；通过基因重组技术将DT分子中的R区突变失活或删除,再用能特异性识别肿瘤细胞表面分子的结构,比如细胞因子、单克隆抗体等,取代R区的位置,这样就能构建成白喉毒素类免疫毒素,它既能靶向结合肿瘤细胞,又能靶向杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞低毒。根据肿瘤细胞表面表达的特异性受体而对构建免疫毒素载体进行选择,无外乎是能与之结合抗体、细胞因子及激素等。B细胞活化因子(B lymphocyte activating factor, BAFF),也是一种细胞因子,可以与其在B细胞系细胞表面表达的受体结合,因此适宜作为免疫毒素的靶向载体。本研究就是以此为思路,利用截断的DT388与B细胞活化因子(BAFF)通过基因重组技术构建重组免疫毒素DT388sBAFF。研究目的：构建免疫毒素白喉毒素／人B细胞活化因子融合蛋白(DT388sBAFF)表达载体,诱导表达、鉴定并纯化。研究方法：1.根据白喉毒素／人B细胞活化因子(DT388sBAFF)优化合成的基因序列设计引物,经PCR扩增将DT388sBAFF插入到克隆载体pMD19-T,阳性克隆质粒通过菌落PCR筛选阳性克隆,提取DNA后经限制性内切酶双酶切,最后进行DNA测序鉴定确定目的基因序列。2.阳性克隆质粒pMD19-T-DT388sBAFF经双酶切(NdeⅠ、XhoⅠ),通过琼脂糖凝胶电泳分离出目的基因DT388sBAFF,再插入表达载体pcold Ⅱ中,构建重组表达载体pcold Ⅱ-DT388sBAFF,转化BL21感受态菌株发酵,后经菌落PCR鉴定阳性菌株。3.将阳性单克隆菌落挑取进行扩增培养,观察至对数生长期后,通过IPTG诱导,行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定融合蛋白(DT388sBAFF)。4.利用Ni2+-NTA层析柱纯化融合蛋白DT388sBAFF,后经透析,并通过SDS-PAGE分析检测融合蛋白。结果：1.成功构建了人克隆质粒pMD19-T-DT388sB AFF,克隆基因序列的测序结果与目的基因DT388sBAFF序列完全一致。2.重组表达载体pcold Ⅱ-DT388sBAFF转化BL21,经IPTG诱导,超声破菌,SDS-PAGE结果显示包涵体内的明显蛋白条带出现在58.4KD处,符合目的蛋白DT388sBAFF大小,获得的融合蛋白通过利用图像扫描分析,结果显示其占菌体总蛋白的比例约为40%,Western blot检测显示融合蛋白分别与两种抗体(抗His-Tag多克隆抗体和抗BAFF多克隆抗体)均发生了特异性结合反应,这表明获得的融合蛋白为特异性目的蛋白DT388sBAFF,它以包涵体形式存在。3.融合蛋白DT388sBAFF利用Ni2+-NTA层析柱进行纯化,后经凝胶图像扫描分析,最终目的蛋白DT388sBAFF纯度达90%以上。结论：利用基因克隆技术成功构建了白喉毒素／人B细胞活化因子(DT388sBAFF)基因原核表达质粒pcold Ⅱ-DT388sBAFF,在转化BL21感受态细胞之后获得了稳定表达的工程菌株,并且在此过程中对融合蛋白DT388sBAFF的表达条件、提取包涵体步骤以及其纯化工艺等进行了探索优化。第二部分白喉毒素／人B细胞活化因子融合蛋白的生物学活性检测研究背景B细胞活化因子(B lymphocyte activating factor, BAFF),也被称为BLyS的(B-淋巴细胞刺激因子),TALL-1(TNF-α和APOL相关白细胞表达配体1),或THANK(肿瘤坏死因子同源物,激活细胞凋亡,NKFB,和JNK),是TNF(肿瘤坏死因子)的超家族的成员,表达在单核细胞,树突状细胞(DC),嗜中性粒细胞,基质细胞,活化T细胞,恶性B细胞和上皮细胞等表面。BAFF的受体有三种：BAFF-R, TACI (transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor,跨膜活化剂和钙的调制器和亲环素配体相互作用因子)和BCMA(B cell maturation protein, B细胞的成熟蛋白),它他们表达在B细胞发育的不同时区。BAFF-R主要在更成熟的B细胞中表达,从T1的过渡性B细胞阶段开始。然而,最近的研究提出的证据表明,BAFF-R普遍表达于B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞,其源于正常B细胞的祖细胞的转化发展。其他的研究表明,构建BAFF和白树种子储藏蛋白(一种植物毒素)融合蛋白表现出对BAFF-R (+) B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用。融合蛋白对BAFF-R (+) B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用取决于两个方面,一是融合蛋白与这种细胞的结合能力,另一方面是融合蛋白的毒性基团对这种细胞的杀伤作用。结合能力主要是由细胞表面表达BAFF受体能力决定。Hmy2.CIR细胞是利用B淋巴母细胞构建的试验用细胞株。利用实时荧光定量PCR技术检测Hmy2.CIR细胞上BAFF受体mRNA表达水平,利用荧光素标记技术检测重组免疫毒素与Hmy2.CIR细胞结合能力,最后利用细胞毒实验检测重组蛋白对Hmy2.CIR细胞的杀伤作用。研究目的检测免疫毒素DT388sBAFF(白喉毒素／人B细胞活化因子融合蛋白)的生物学活性。研究方法1.利用实时荧光定量PCR技术检测B细胞株Hmy2.CIR细胞上BAFF三种受体(BAFF-R、TACI和BCMA)的表达水平。2.利用FITC荧光素标记技术检测重组免疫毒素DT388sBAFF与B细胞株Hmy2.CIR细胞结合能力。3.重组免疫毒素DT388sBAFF对Hmy2.CIR细胞的杀伤作用的检测采用细胞毒性实验实施。4.利用SPSS18.0统计软件中的方差分析功能对结果进行统计学分析。结果1.BAFF的三种受体BAFF-R、TACI和BCMA在B细胞株Hmy2.CIR细胞都表达,其中BAFF-R表达最高。2.在倒置荧光显微镜下可观察利用FITC荧光素标记融合蛋白DT388sBAFF后的Hmy2.CIR细胞,视野里发现有较强绿色荧光出现,而对照阴性组U937细胞视野则未见荧光,此结果表明融合蛋白DT388sBAFF与表达于Hmy2.CIR细胞表面的BAFF受体能够特异性的结合。3.融合蛋白DT388sBAFF对Hmy2.CIR细胞较强的抑制作用通过细胞毒实验检测结果得以显现,且具有剂量依赖关系,即随着融合蛋白DT388sBAFF浓度的增加,Hmy2.CIR细胞被抑制的效应越强(P<0.05),而不同浓度的融合蛋白DT388sBAFF之于对照阴性组U937细胞没有显示具有统计学意义的抑制效应(P>0.05)。结论获得了具有靶向B细胞活性的免疫毒素DT388sBAFF,为其在B细胞恶性肿瘤及自身免疫性疾病治疗中的应用研究奠定了基础。第三部分白喉毒素／人B细胞活化因子融合蛋白对人急性白血病BALL-1细胞杀伤作用研究背景急性白血病(acute leukemia)是儿童常见的血液系统肿瘤,急性淋巴细胞白血病约占70%,其中80%来源于B细胞系,其发生率和病死率均呈上升趋势,严重威胁人类,特别是儿童的健康。通常采用的联合化疗的治疗方法,但这些治疗措施抗肿瘤能力低,也就是选择性差,并有明显的全身毒副作用。长期使用非特异免疫抑制剂容易诱导药物耐药,并可使患者免疫功能受到严重损害,导致许多并发症。免疫毒素由于其靶向治疗的特点成为当前肿瘤治疗研究的热点领域之一。免疫毒素主要通过毒性分子中的不同结构域间的协调配合而发挥杀伤作用,其过程主要包括：免疫毒素中的载体发挥靶向作用与目标细胞结合；免疫毒素中的毒性分子内化入细胞；毒性分子的活性作用主要是抑制蛋白表达,以致细胞死亡。免疫毒素的毒性部分主要来源有一下几类：植物来源的毒素、细菌来源的毒素、人源性蛋白毒素以及真菌来源的毒素等。白喉毒素属于细菌来源的毒素,含有于细胞结合区和酶活性区,C片段是其酶活性区,主要活性作用是失活核蛋白体上的肽链EF-2,从而抑制细胞合成蛋白质,导致细胞变性坏死,应用这个优势特性发挥杀伤肿瘤细胞的作用。本研究通过以白喉毒素为毒性部分而构建免疫毒素DT388sBAFF来探讨其是否对人急性白血病BALL-1细胞存在抑制作用,从而为急性白血病治疗提供新的研究方向。研究目的研究免疫毒素DT388sBAFF(白喉毒素／人B细胞活化因子融合蛋白)的对人急性白血病BALL-1细胞的杀伤作用。研究方法1.利用实时荧光定量PCR技术检测人急性白血病BALL-1细胞上BAFF三种受体(BAFF-R、TACI和BCMA)的表达水平。2.利用FITC荧光素标记技术检测重组免疫毒素DT388sBAFF与人急性白血病BALL-1细胞结合能力。3.细胞毒性实验检测重组免疫毒素DT388sBAFF对人急性白血病BALL-1细胞的杀伤作用。4.利用SPSS18.0统计软件中的方差分析功能对结果进行统计学分析。结果1.BAFF的三种受体(BAFF-R、TACI和BCMA)中,只有BAFF-R在人急性白血病BALL-1细胞上高表达(P<0.05),TACI和BCMA基本不表达(P>0.05)。2. FITC荧光素标记重组免疫毒素DT388sBAFF后在倒置荧光显微镜下可观察到人急性白血病BALL-1细胞有较强绿色荧光出现,而阴性对照组U937细胞则未见荧光,而阳性对照Hmy2.CIR细胞亦出现较强绿色荧光,而且急性白血病BALL-1细胞和阳性对照Hmy2.CIR细胞只同时表达BAFF一种受体：BAFF-R,这表明重组免疫毒素DT388sBAFF与上述细胞表面受体BAFF-R具有特异性结合能力。3.细胞毒实验检测结果显示了较强的抑制效应,即重组免疫毒素DT388sBAFF能抑制人急性白血病BALL-1细胞,且具有剂量依赖关系,即人急性白血病BALL-1细胞受抑制作用随着重组免疫毒素DT388sBAFF浓度的增加,而越强(P<0.05),这与阳性对照细胞Hmy2.CIR细胞结果一致(P<0.05),而不同浓度的重组免疫毒素DT388sBAFF之于对照阴性组U937细胞没有显示具有统计学意义的抑制效应(P>0.05)。结论免疫毒素DT388sBAFF具有靶向杀伤人急性白血病BALL-1细胞的活性,为人急性白血病治疗提供了新的研究方向。