近年来,骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗缺血性心脏病已成为心血管领域的研究热点,然而移植后的细胞能否在缺血区长期、大量存活是首先需要解决的难题,很多研究者已认识到对于缺血心肌的治疗关键在于血运的重建,这也是移植细胞能否长期存活的关键。因此,骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞(EC)分化,促进局部血管新生,改善心肌缺血成为心血管研究领域的新热点。大量研究显示:中药对MSCs的诱导分化有一定的作用。基于益气活血法研制的中药复方芪丹通脉片是治疗缺血性心脏病的有效方剂,既往研究发现预防性给予芪丹通脉片可提高心肌缺血大鼠心室内血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达,增加缺血区的微血管密度(MVD),而且VEGF、bFGF具有诱导MSCs向EC分化的作用。本研究通过体外分离培养大鼠MSCs,从离体和在体两方面,分别观察芪丹通脉片含药血清对体外培养的MSCs的诱导分化作用,以及服用芪丹通脉片对移植后体内MSCs的诱导分化作用,并观察芪丹通脉片协同MSCs移植与单纯MSCs移植治疗大鼠急性心肌缺血时心功能、心肌细胞凋亡、缺血区微血管密度的变化。从全新的MSCs诱导分化角度探讨益气活血复方的血管新生作用,为益气活血法治疗缺血性心脏病提供新的理论和实验依据,并为临床协助MSCs移植治疗缺血性心脏病提供一种有效的治疗手段。〖第一部分〗大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与培养目的:应用贴壁分离法和密度梯度离心法以不同培养条件观察纯化过程中对获得的MSCs的影响,试图寻找获得高质量、高活性的MSCs的培养条件。方法:SPF级幼龄SD大鼠18只,贴壁分离培养取12只,根据血清和培养基的不同分为4组:进口血清+DMEM组、进口血清+F12-DMEM组、国产血清+DMEM组、国产血清+F12-DMEM组,3只/组。密度梯度离心培养实验取剩余6只,以分离液的不同分为Ficoll分离液组、Percoll分离液组,3只/组。观察贴壁分离、密度梯度离心不同培养条件下细胞的活体形态特征,用锥虫蓝排斥试验检测细胞活性,绘制生长曲线。结果:①细胞形态观察结果:贴壁分离法:采用进口血清培养的两组细胞形态学上都表现为长梭形,细胞活性较高,且给予F12-DMEM培养基的细胞增殖较快,集落融合较早,传代所需时间短;采用国产血清培养的两组细胞中,给予F12-DMEM培养基可以获得梭形细胞,而给予DMEM培养基则多为类圆形骨髓样细胞,仅见极少梭形细胞。密度梯度离心法中Ficoll分离液组和Percoll分离液组均可培养出梭形MSCs,细胞活性均高,但集落融合、传代所需的时间均较贴壁分离法长。②细胞活性检测结果:贴壁分离法:进口血清+DMEM组、进口血清+F12-DMEM组、国产血清+DMEM组、国产血清+F12-DMEM组的活细胞率分别为98.3%,98.7%,97.1%,97.7%,组间比较差异无显著性意义(p>0.05)。密度梯度离心法:Ficoll分离液组活细胞率与Percoll分离液组相似96.9%,97.1%,(p>0.05)。③第3代细胞生长曲线测定结果:不同培养条件下各组第3代细胞生长曲线基本相似,在培养1d时,细胞量稍有减少;4d后细胞数均迅速增长;8d进入平台期,细胞增殖减慢。结论:采用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法,只要选择合适的培养条件均可获得MSCs,但选用进口胎牛血清、F12-DMEM培养基效果较好。〖第二部分〗芪丹通脉片含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的实验研究目的:观察芪丹通脉片含药血清体外诱导大鼠MSCs向EC分化的作用。方法:制备芪丹通脉片含药血清与对照血清,密度梯度离心法分离和培养大鼠MSCs,采用10μg/L VEGF预诱导24h后,分别加入15%芪丹通脉片含药血清与15%对照血清体外对MSCs进行诱导分化共7d,利用相差显微镜分别观察诱导后第1d、第3d、第5d和第7d细胞的形态改变,收集含药血清组第1、3、5、7d的细胞、对照血清组第7d的细胞以及脐静脉血管内皮细胞(消化科洪流博士惠赠),用Westernblot法检测各组细胞匀浆中Tie2、CD31蛋白的表达。利用透射电镜观察两组诱导后第7d细胞超微结构,免疫荧光方法检测两组诱导后第7d内皮细胞特异性表面标志CD31、Ⅷ因子的表达。结果:①形态学改变:第1d,两组细胞形态均无明显改变,第3d,芪丹通脉片含药血清组原有的梭形细胞胞体稍有回缩。第5d,细胞胞体回缩,间距增大,立体感增强。至第7d,胞体形态具有呈多角形、呈现“铺路石”样改变。对照血清组细胞形态一直无改变。②Tie2、CD31蛋白的表达:细胞总蛋白Western blot结果提示:对照血清组细胞无Tie2、CD31蛋白的表达,芪丹通脉片含药血清组诱导1d后细胞即有微量Tie2、CD31蛋白的表达,诱导3、5、7d后细胞Tie2、CD31蛋白表达逐渐增强,以第7d表达最明显,并与脐静脉血管内皮细胞Tie2、CD31蛋白表达相近。③超微结构:诱导7d后,芪丹通脉片含药血清组细胞电镜下,细胞胞浆内可见内皮细胞所特有的短棒状细胞器Weible-Palade小体,而对照血清组细胞电镜下胞浆内无Weible-Palade小体。④CD31、Ⅷ因子的表达:诱导7d后,芪丹通脉片含药血清组免疫荧光提示:共聚焦显微镜下可见CD31及Ⅷ因子阳性表达细胞,而对照血清组细胞表面CD31、Ⅷ因子表达阴性。结论:益气活血复方芪丹通脉片含药血清具有体外诱导大鼠MSCs向EC定向分化的作用。〖第三部分〗芪丹通脉片诱导移植后骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的作用研究目的:探讨芪丹通脉片诱导移植后MSCs在大鼠缺血心肌组织中分化为EC的作用,以及芪丹通脉片联合MSCs移植对大鼠缺血心肌的病理改变、微血管密度、心肌细胞凋亡、心功能的影响。方法:采用密度梯度离心法分离和纯化大鼠MSCs,培养扩增至第3代后,应用溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记细胞。20只SD大鼠随机分为两组:芪丹通脉片联合移植组和单纯移植组,分别灌服芪丹通脉片浸膏干粉溶液2g生药/kg及等体积的生理盐水,每日1次,连续14d。结扎大鼠冠状动脉左前降支,制备急性心肌梗死模型,将BrdU标记的异体MSCs以微量注射的方法移植入缺血心肌内。于移植后3h与移植后4w应用12-MHz探头的超声心动仪检测两组大鼠心功能的改变情况。于移植后4w处死两组大鼠,肉眼观察结扎部位的大体表现,并用HE染色观察其缺血区病理改变,用免疫荧光鉴定移植后4w两组移植细胞表面Tie2及Ⅷ因子的表达,以CD31阳性细胞计算和比较两组的微血管密度(MVD),应用TUNEL法检测移植后4w两组大鼠缺血区心肌细胞的凋亡情况。结果:芪丹通脉片联合移植组大鼠结扎部位心肌呈淡粉色,与周围正常心肌颜色相近;而单纯移植组结扎部位心肌仍呈苍白色,局部组织轻度水肿;HE染色结果显示:芪丹通脉片联合移植组缺血改变较单纯移植组明显改善。芪丹通脉片联合移植组和单纯移植组大鼠左室均发现BrdU阳性细胞即植入细胞,而芪丹通脉片联合移植组,BrdU阳性细胞中Tie2和Ⅷ因子阳性信号表达程度均高于单纯移植组,微血管密度高于单纯移植组,而TUNEL阳性心肌细胞较单纯移植组明显减少,凋亡指数明显降低。移植后3h两组大鼠左室短轴缩短率(FS)分别为31.7±1.3、32.8±1.5。前室壁增厚率(AWTF)及后室壁增厚率(PWTF)分别为32.1±2.1、33.4±2.3和46.3±1.1、46.7±1.5。移植后4w两组大鼠左室短轴缩短率(FS)分别为48.1±2.3、43.3±1.6。前室壁增厚率(AWTF)及后室壁增厚率(PWTF)分别为41.8±2.2、37.9±2.0和46.5±1.2、46.6±1.5。芪丹通脉片联合移植组与单纯移植组两组大鼠心功能均有所改善,而芪丹通脉片联合移植组改善更明显。结论:芪丹通脉片具有促进MSCs在缺血心肌中转化为EC的作用。芪丹通脉片联合MSCs移植能改善急性心肌缺血大鼠的心功能,减少心肌细胞凋亡,增加缺血区MVD,与MSCs单纯移植组比较疗效更显著。