论文部分内容阅读
背景与目的:鼻咽癌（NPC）是发病原因尚未完全清楚的一种上皮恶性肿瘤。中国南方、东南亚和北非的某些地区该肿瘤较为常见。目前认为EB病毒感染、环境及遗传因素与鼻咽癌的发生发展有着密切关系。单独放疗以及放化疗联合治疗是目前的主要治疗手段。然而发生转移的鼻咽癌患者即使进行规范的治疗,其五年复发率仍可达82%,五年生存率依然很低[1]。因而明确鼻咽癌的发生发展、侵袭转移机制,进而找到治疗鼻咽癌的有效靶点显得迫在眉睫。总体而言,NOTCH信号在鼻咽癌中可以促进血管生成、肿瘤侵袭和转移。然而,四种NOTCH受体分别在鼻咽癌发病中的确切作用及其分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨NOTCH2对人鼻咽癌细胞生长增殖及侵袭转移的影响,并明确NOTCH2调控鼻咽癌细胞生物学行为的相关分子机制。本研究分为三个部分:第一部分NOTCH2表达水平与鼻咽癌转移及患者生存时间的关系研究目的:探究NOTCH2表达对鼻咽癌转移能力、患者生存时间以及恶性程度的影响。研究方法:1.利用免疫荧光组织染色以及免疫组化组织染色检测颈淋巴结已发生转移患者与颈淋巴结未发生转移患者其鼻咽癌肿瘤组织中NOTCH2的表达差异。2.利用Kaplan-Meier生存分析法分析NOTCH2表达与患者的生存时间的关系。3.利用免疫印迹（Western blot）检测低分化的鼻咽癌细胞（CNE-2）,高分化的鼻咽癌细胞（CNE-1）,高转移的鼻咽癌细胞（5-8F）,低转移的鼻咽癌细胞（6-10B）中NOTCH2和NOTCH2胞内段（N2ICD）的蛋白表达差异。结果:1.颈淋巴结已发生转移患者,其鼻咽癌肿瘤组织相较于未发生颈部淋巴结转移的鼻咽癌组织NOTCH2表达明显降低（P<0.05）。2.Kaplan-Meier生存分析发现NOTCH2表达降低与患者预后不良呈正相关,该部分患者生存时间缩短（P<0.05）。3.免疫印迹发现NOTCH2和N2ICD蛋白在CNE-2细胞中的表达显著低于CNE-1;NOTCH2和N2ICD蛋白在5-8F细胞中的表达显著低于6-10B。结论:NOTCH2在伴有颈部转移的鼻咽癌组织以及高转移、低分化的鼻咽癌细胞内表达显著降低。NOTCH2与鼻咽癌患者生存时间负性相关。第二部分NOTCH2对鼻咽癌细胞生长增殖及侵袭转移能力的抑制作用研究目的:探究抑制或过表达NOTCH2对鼻咽癌细胞生长增殖、侵袭转移的影响。研究方法:1.利用慢病毒包装的NOTCH2-shRNA质粒感染并构建NOTCH2基因表达受到抑制的鼻咽癌细胞;以慢病毒LV-NOTCH2感染并构建稳定过表达NOTCH2的鼻咽癌细胞。2.利用克隆形成实验检测NOTCH2与鼻咽癌细胞体外生长增殖的关系。3.利用裸鼠移植瘤模型检测NOTCH2与鼻咽癌细胞体内生长增殖的关系。4.利用划痕实验检测NOTCH2与鼻咽癌细胞体外迁移能力的关系。5.利用transwell实验检测NOTCH2与鼻咽癌细胞的体外侵袭、转移能力的关系。6.利用转移瘤模型检测NOTCH2与鼻咽癌细胞的体内转移能力的关系。7.利用鬼笔环肽染色观察细胞骨架分析NOTCH2与鼻咽癌细胞形态关系。8.利用流式细胞术检测NOTCH2与鼻咽癌细胞的干细胞化关系。9.利用免疫荧光细胞染色和免疫印迹验证NOTCH2与鼻咽癌细胞的EMT标记蛋白E-cadherin以及Vimentin表达的关系。结果:1.成功构建了抑制NOTCH2基因表达的鼻咽癌细胞（shNOTCH2CNE-2细胞、shNOTCH2 5-8F细胞）以及稳定过表达NOTCH2的鼻咽癌细胞（oeNOTCH2 CNE-2细胞、oeNOTCH2 5-8F细胞）。2.shNOTCH2鼻咽癌细胞的集落形成能力明显快于Ctrl鼻咽癌细胞（P<0.05）,oeNOTCH2鼻咽癌细胞的集落形成能力明显慢于oeVec（对照）鼻咽癌细胞（P<0.05）。3.shNOTCH2鼻咽癌组裸鼠瘤体体积显著大于Ctrl鼻咽癌组裸鼠瘤体体积（P<0.05）。4.shNOTCH2鼻咽癌细胞的迁移距离明显远于Ctrl鼻咽癌细胞,oeNOTCH2鼻咽癌细胞的迁移距离明显短于oeVec鼻咽癌细胞。5.shNOTCH2鼻咽癌细胞穿膜细胞数量明显多于Ctrl鼻咽癌细胞（P<0.05）,oeNOTCH2鼻咽癌细胞穿膜细胞数量明显少于oeVec鼻咽癌细胞（P<0.05）。6.shNOTCH2组肺表面出现转移灶的裸鼠数量明显多于Ctrl组表面出现转移灶的裸鼠数量（P<0.05）,shNOTCH2组肝表面出现转移灶的数量明显多于Ctrl组肝表面出现转移灶的数量（P<0.05）。7.抑制NOTCH2能够使鼻咽癌细胞发生间充质样改变:细胞从正常上皮细胞外观变成细长纺锤丝状,成纤维细胞形态。8.shNOTCH2组CD133+细胞的数量显著多于Ctrl组（P<0.05）。9.相对于Ctrl组,shNOTCH2组鼻咽癌细胞E-cadherin低表达,vimentin高表达;相对于oeVec组,oeNOTCH2组鼻咽癌细胞E-cadherin高表达,vimentin低表达。结论:NOTCH2能够阻滞鼻咽癌细胞体外及体内生长增殖及侵袭转移。NOTCH2能够抑制鼻咽癌细胞发生间充质样改变及干细胞化。第三部分NOTCH2调控鼻咽癌细胞侵袭转移的分子机制研究目的:探究NOTCH2抑制鼻咽癌细胞生长增殖及侵袭转移的分子机制。研究方法:1.利用生物信息学分析筛选与NOTCH2调控鼻咽癌生物学行为有关的信号通路。2.利用免疫印迹验证该信号通路是否确实参与NOTCH2调控鼻咽癌的生物学行为。3.抑制该信号通路表达,利用鬼笔环肽染色观察细胞骨架了解抑制该通路能否阻断NOTCH2受抑制时鼻咽癌细胞的形态学变化。4.利用transwell实验观察抑制该通路能否阻断NOTCH2受抑制时鼻咽癌细胞迁移、转移能力变化。5.利用免疫印迹检测抑制该通路能否阻断NOTCH2受抑制时鼻咽癌细胞的EMT标记蛋白E-cadherin和Vimentin表达的影响。6.利用免疫印迹实验寻找与NOTCH2调控鼻咽癌生物学行为有关的该通路的上游分子（X）。7.通过慢病毒感染并构建抑制X表达并抑制NOTCH2表达的CNE-2细胞,免疫印迹验证是否构建成功。8.利用鬼笔环肽染色观察细胞骨架检测抑制X能否阻断NOTCH2受抑制后鼻咽癌细胞的形态变化。9.利用transwell实验检测抑制X能否阻断NOTCH2受抑制后鼻咽癌细胞迁移、转移能力的变化。10.利用免疫印迹检测抑制X能否阻断NOTCH2受抑制后引起的鼻咽癌细胞EMT。11.利用免疫荧光双标染色定位NOTCH2胞内段（N2ICD）与X的位置。12.利用免疫共沉淀验证N2ICD与X的关系。结果:1.通过生物信息学分析筛选出MAPK及PI3K/AKT信号通路与NOTCH2调控鼻咽癌的生物学行为有关。2.通过免疫印迹证实PI3K/AKT信号通路与NOTCH2调控鼻咽癌的生物学行为有关。3.观察LY294002（AKT抑制剂）处理的shNOTCH2鼻咽癌细胞骨架发现AKT抑制剂能够阻断NOTCH2受抑制后鼻咽癌细胞形态变化:细胞仍为对照CNE-2细胞的上皮细胞形态。4.shNOTCH2+LY294002 CNE-2细胞迁移（无基质胶）和转移能力（有基质胶）与Ctrl CNE-2组细胞迁移和侵袭能力相同（P>0.05）,而较shNOTCH2 CNE-2细胞迁移和侵袭能力减弱（P<0.05）。5.shNOTCH2+LY294002 CNE-2细胞中E-cadherin和Vimentin的表达水平与Ctrl CNE-2细胞表达水平无显著差异（P>0.05）;但该组细胞E-cadherin表达较shNOTCH2 CNE-2细胞明显上调（P<0.05）,而Vimentin表达明显下调（P<0.05）。6.shNOTCH2 CNE-2细胞组相对于Ctrl CNE-2细胞组,TRAF6表达明显上调（P<0.05）;oeNOTCH2 CNE-2细胞相对于oeVec CNE-2细胞组,TRAF6表达明显下调（P<0.05）。7.免疫印迹证实shNOTCH2+shTRAF6CNE-2细胞NOTCH2和TRAF6蛋白表达下调。8.观察细胞骨架发现抑制TRAF6能够阻断NOTCH2受抑制后鼻咽癌细胞形态的变化:细胞仍为对照CNE-2细胞的上皮细胞形态。9.shNOTCH2+shTRAF6 CNE-2细胞迁移（无基质胶）和转移能力（有基质胶）与Ctrl CNE-2组细胞迁移和侵袭能力相同（P>0.05）,而较shNOTCH2 CNE-2细胞迁移和侵袭能力减弱（P<0.05）。10.shNOTCH2+shTRAF6CNE-2细胞中E-cadherin和Vimentin的表达水平与Ctrl CNE-2细胞表达水平无显著差异（P>0.05）;而其E-cadherin表达较shNOTCH2 CNE-2细胞显著上调（P<0.05）,Vimentin表达则显著下调（P<0.05）。11.NOTCH2胞内段（N2ICD）与TRAF6在鼻咽癌细胞的细胞质中存在共定位。12.N2ICD与TRAF6能够直接物理结合。结论:鼻咽癌细胞中NOTCH2调控了TRAF6/AKT信号通路。抑制AKT或者其上游分子TRAF6可以阻断鼻咽癌细胞NOTCH2受抑制后的细胞形态学变化、侵袭转移能力变化及EMT的发生。综合上述实验结果,本研究证实NOTCH2与鼻咽癌患者生存时间呈负性相关,NOTCH2在鼻咽癌组织中起抑制转移的作用。本研究证实NOTCH2与TRAF6直接结合后通过TRAF6/AKT信号轴调控鼻咽癌细胞ETM,最终抑制鼻咽癌细胞侵袭转移,是鼻咽癌治疗特别是控制转移的潜在靶点。