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艾滋病已成为一场人类、社会和经济的灾难,对个人、社区和国家都产生了深远影响。目前常用的艾滋病治疗方法是化学药物的鸡尾酒疗法,该方法可明显降低患者体内的病毒载量,控制病情的发展。然而,该方法并不能达到治愈艾滋病的效果,急需开发新的更为有效的治疗方法。RNAi是近年来发现的一种序列特异性的转录后水平抑制基因表达的机制,目前已在HIV-1的抗病毒研究中显示出巨大的应用潜力。然而,HIV-1具有的高突变率使得病毒很容易逃避传统的单靶点RNAi的抑制。多靶点策略是克服病毒突变逃避抑制的有效方法,本研究的目的即在于筛选靶向HIV-1的高效的RNAi靶点并通过人工簇状miRNA结构实现多个抗病毒siRNA的共表达,以获得更为理想的抗病毒效果,为进一步应用RNAi技术进行新型艾滋病治疗方法的研究提供重要的基础。
本研究首先通过规模化筛选获得靶向HIV-1的兼具高抑制效率和高保守性特征的RNAi靶位点。以HIV-1NL4-3为靶序列选择设计了153个siRNA,主要分别靶向gag、pol、vif,vpu基因,在pSUPER质粒上构建了对应的shRNA表达质粒。各shRNA表达质粒分别与HIV-1感染性克隆pNL4-3共转染293FT细胞,通过检测细胞培养上清中HIV-1编码蛋白p24的活性,筛选出具有高抑制效率的RNAi靶序列。同时通过保守性分析、干扰素免疫反应的检测及进一步的对多亚型病毒的抑制效率实验筛选获得4个兼具高抑制率和高保守性特征的RNAi靶位点,分别为po11102和po11026(靶向pol基因),vif37和vif9(靶向vif基因)。将RNAi的靶序列插入到荧光素酶基因的3UTR区,构建了一系列的报告质粒。pSUPER-shRNA分别与对应的报告质粒的共转染,po11102、po11026、vif37和vif9仅仅抑制含有相应靶序列的报告基因的表达,证明了抑制效果的特异性。本研究进一步选择Do11102和vif37靶点分别构建shRNA表达元件及通过化学方法合成siRNA验证其在细胞感染模型中的抗HIV-1的能力。MT-4是能够支持HIV-1体外复制的T淋巴细胞系。本研究构建了携带靶向po11102和vif37靶点的shRNA表达元件的重组慢病毒载体,转导MT-4细胞分别筛选获得了可稳定表达靶向po11102和vif37靶点的siRNA的细胞株,攻毒实验显示上述细胞株可有效抑制HIV-1的感染和复制。本研究通过化学方法进一步合成了靶向vif37靶点的siRNA,分别采用不修饰、甲氧基修饰、胆固醇修饰的合成方式,检测结果显示3种修饰方式合成的siRNA均能够有效抑制HIV-1的复制表达,其半数抑制剂量(ED50)分别为1nmol、1nmol、2nmol。
本研究显示对稳定表达靶向po11102和vif37靶点的siRNA的MT-4细胞株进行长期连续攻毒实验可获得逃避抑制的突变病毒,本研究对11株vif37靶点的突变株进行了靶点区域的测序分析,发现病毒突变集中于RNAi靶点区中部的两个位点,突变方式主要是同义突变或者同类氨基酸替换。该结果这说明单靶点策略是不足以应对HIV-1的突变逃避的,采用多靶点抑制策略是十分必要的。天然miRNA中存在少量的簇状结构,一个顺反子经过剪切、加工后可以得到多个不同的成熟miRNA,本研究探索采用以天然miRNA基因簇骨架构建多靶点RNAi元件。以天然簇状miRNA(miR-17-92)为骨架,将其中的miRNA序列(miRNA17、18、19a、20、和19b-1)分别替换为siP24、siPOL、siVIF1、siVIF2、siTAT的序列,得到可同时表达5个抗病毒siRNA的簇状miRNA结构BHS。BHS分别与含靶点序列的荧光素酶报告质粒共转染,结果显示5个siRNA中只有siTAT较好的保持了抑制效果,并没有达到同时表达多个抗病毒siRNA的目的。本研究还尝试将两个有效的抗病毒miRNA前体直接相连,构建2靶点RNAi表达结构,但是两个靶点中只有一个较好的保持了抑制效果。
分析了上述的实验结果并考虑到HIV-1的基因组中含有天然的miRNA,本研究重新设计了构建多靶点RNAi元件的策略,以源自HIV-1的反义RNA序列作为连接序列,采用灵活的克隆构建方法,将多个抗病毒miRNA以不同的组合和顺序连接起来,得到不同的人工簇状miRNA结构,用实验的方法从中选出有多靶点RNAi效果的表达结构。通过以天然的miRNA(miR-30a或miR-155)为骨架构建靶向HIV-1的19011102、po11026、po11402、vif9和vif37靶点的miRNA元件,采用与HIV-1感染性克隆共转染的方式检验获得有效的单个miRNA表达结构。在获得有效的单个miRNA元件序列的下游添加一段HIV-1反义RNA构成的连接序列,组成一个包含miRNA前体和连接序列的串联单元,并用共转染荧光素酶报告基因的方式,选择具有抑制效果的单元进行后续的多靶点元件组合实验。将获得的靶向po11402、po11102和vif37靶点的miRNA串联单元以不同的组合和顺序连接成为不同的3靶点miRNA结构,通过抑制效率评价实验筛选获得了一组具有良好3靶点抑制效果的簇状miRNA组合结构(tri-miRNA),其对HIV-1的抑制效果优于单个的miRNA元件,并可以有效抑制逃逸突变的产生。在脱靶效应评价实验中,tri-miRNA在细胞中的稳定表达不会影响细胞的增殖,不会干扰内源性的天然miRNA的加工、成熟,也不会引发干扰素免疫反应,没有检测到明显的细胞毒性。为进一步验证本研究的多靶点簇状miRNA构建方法的适用性,进一步在tri-miRNA的下游添加了两个miRNA串联单元,得到含有5个miRNA的簇状miRNA组合结构(quin-miRaNA),其对应靶点依次为po11402、vif37、po11102、po11217和po11026。Quin-miRNA中有4个miRNA在荧光素酶共转染实验中表现出明显的抑制效果,在细胞中的稳定表达没有检测到可见的副作用,可以高效抑制病毒的复制。本研究探索建立了构建高效靶向HIV-1的多靶点RNAi元件的构建策略,获得了一批高效的RNAi靶点和具有较好应用潜力的多靶点RNAi元件,为进一步以RNAi技术为基础开展HIV-1治疗研究提供了重要基础。