研究背景癌症是世界人口死亡的主要原因之一。肺癌的发病率居2020年癌症发病率第二位,也是癌症死亡的主要原因,而非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的主要类型。双氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）是中药青蒿（Artemisia annua L.）的主要有效成分青蒿素（artemisia,ART）的一种衍生物,研究发现双氢青蒿素有抗肿瘤活性,但双氢青蒿素抗非小细胞肺癌的效果和作用机制并不明确。研究目的本课题选用A549和Lewis肺癌细胞株（Lewis lung cancer,LLC）进行细胞实验,并通过腋下接种肿瘤细胞的方式建立荷瘤小鼠模型进行体内验证,探讨双氢青蒿素通过调节mTOR/HIF-1α信号通路抑制非小细胞肺癌生长的分子机制,为进一步阐明双氢青蒿素的抗癌机制以及开发新的临床治疗方案提供理论依据。研究内容与方法第一部分1、体外实验证实双氢青蒿素抑制非小细胞肺癌生长利用非小细胞肺癌细胞株A549和LLC为研究对象,通过MTS法检测1μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM双氢青蒿素对上述细胞活性的影响;通过克隆形成实验检测5μM、10μM、50μM双氢青蒿素对上述细胞增殖的影响;通过流式细胞术检测双氢青蒿素对细胞周期调控和细胞凋亡的影响;通过Western bolt检测双氢青蒿素对细胞周期和细胞凋亡相关蛋白表达的影响。2、建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型并评价双氢青蒿素体内抑瘤效果。接种LLC细胞并成瘤的C57BL/6雌性小鼠随机分为溶剂对照组（DMSO）、顺铂（2 mg/kg）治疗组（Cisplatin,DDP）、双氢青蒿素12.5 mg/kg治疗组、双氢青蒿素25 mg/kg治疗组、双氢青蒿素50 mg/kg治疗组,每组6只,腹腔注射连续给药14天。每三天测量并记录一次肿瘤大小和小鼠体重。最后一次给药24h后获取肿瘤,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片后进行免疫组化Ki-67染色,采图并统计分析Ki-67的变化。第二部分1、探究双氢青蒿素抑制非小细胞肺癌的潜在分子机制采用网络药理学技术,通过GO和KEGG分析预测双氢青蒿素抑制非小细胞肺癌的潜在分子机制。2、正反途径验证双氢青蒿素经mTOR/HIF-1α信号通路抑制非小细胞肺癌生长正向给予10μM双氢青蒿素处理A549和LLC细胞株6 h、12 h、24 h和48h,通过Western bolt检测药物作用后p-mTOR和HIF-1α的蛋白表达水平,同时给予12.5 mg/kg双氢青蒿素治疗C57BL/6荷瘤小鼠,通过Western bolt检测荷瘤小鼠肿瘤组织中p-mTOR和HIF-1α的蛋白表达水平。反向给予20μM mTOR激活剂MHY1485对抗10μM双氢青蒿素治疗作用,通过Western blot检测上述处理后的A549和LLC细胞株中p-mTOR和HIF-1α的蛋白表达水平变化,进一步证实双氢青蒿素通过调节mTOR/HIF-1α信号通路抑制非小细胞肺癌的生长。研究结果第一部分1、MTS实验结果表明,双氢青蒿素对A549及LLC细胞株的毒性作用呈剂量依赖关系,随着药物浓度的增高,双氢青蒿素对细胞的抑制作用逐渐增强。双氢青蒿素作用于A549及LLC细胞株的IC50（Half maximal inhibitory concentration,IC50）分别为23.89±9.07μM及8.15±4.83μM。2、克隆形成实验结果表明,与溶剂对照组（Mock组）相比,双氢青蒿素对A549及LLC细胞株的生长抑制呈剂量依赖关系,随着药物剂量的增加,细胞生长形成的克隆数目越少,差异具有统计学意义（P<0.05）。3、流式细胞术检测细胞周期实验结果表明,与Mock组相比,双氢青蒿素将A549细胞株阻滞在G0/G1期,并呈时间和剂量依赖关系,差异具有统计学意义（P<0.05）,而双氢青蒿素更倾向于将LLC细胞阻滞在G2/M期。同时,Western blot实验结果表明,与Mock组相比,双氢青蒿素能下调A549和LLC细胞株中细胞周期相关蛋白的表达,包括CDK2、CDK4、Cyclin D1及Cyclin E1,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明双氢青蒿素可能通过抑制上述周期相关蛋白的表达抑制肿瘤细胞的生长周期。4、流式检测细胞凋亡结果表明,与Mock组相比,双氢青蒿素诱导A549及LLC细胞株的凋亡基本呈剂量依赖关系,随着药物浓度的增加,细胞凋亡比例增加。同时,Western blot实验结果表明,与Mock组相比,双氢青蒿素能下调A549和LLC细胞株中抗凋亡相关蛋白的表达,包括Bcl-2和Bcl-xl,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明双氢青蒿素可能通过抑制抗凋亡相关蛋白的表达,促进肿瘤细胞的凋亡。5、C57BL/6小鼠成瘤实验中,与溶剂对照组相比,顺铂组、双氢青蒿素12.5mg/kg治疗组、双氢青蒿素25 mg/kg治疗组、双氢青蒿素50 mg/kg治疗组肿瘤体积和肿瘤重量明显减小,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明双氢青蒿素具有明显的体内抑瘤效果。6、C57BL/6小鼠成瘤实验中,与溶剂对照组相比,仅双氢青蒿素12.5 mg/kg治疗组体重未见明显下降,而顺铂治疗组、双氢青蒿素25 mg/kg治疗组及双氢青蒿素50 mg/kg治疗组小鼠体重均下降明显,粗略说明12.5 mg/kg是双氢青蒿素治疗C57BL/6小鼠的安全剂量。7、C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤组织免疫组化结果显示,与溶剂对照组相比,双氢青蒿素12.5 mg/kg治疗组中Ki-67蛋白的表达量显著减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,进一步支持双氢青蒿素明显抑制肿瘤细胞的增殖。第二部分1、网络药理学分析表明,双氢青蒿素抗非小细胞肺癌的主要作用机制涉及细胞凋亡过程、平滑肌细胞增殖、活性氧反应、损伤应答等的生物过程,并影响了多个重要的细胞信号通路,如HIF-1信号通路、p53信号通路、NF-κB信号通路、PPAR信号通路、TGF-β信号通路等,为下一步选择双氢青蒿素诱导的关键信号通路奠定了基础。2、进一步的体内体外实验结果表明,与溶剂对照组相比,双氢青蒿素能下调A549和LLC细胞株及C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤组织中p-mTOR和HIF-1α的表达。为了进一步证实mTOR/HIF-1α信号通路在双氢青蒿素抑制肿瘤中的作用,我们采用mTOR激动剂MHY1485对抗双氢青蒿素的治疗作用,发现A549及LLC细胞株中双氢青蒿素抑制p-mTOR和HIF-1α活化的作用得到一定程度的缓解,说明双氢青蒿素抗肿瘤的作用的确通过mTOR/HIF-1α信号通路。研究结论本研究的实验结果表明,双氢青蒿素可以通过mTOR/HIF-1α信号通路调控细胞周期和凋亡相关蛋白的表达从而抑制非小细胞肺癌的生长。