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兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi,E.cuniculi)又称兔脑炎原虫,属脑炎微孢子虫属,能够引起家兔、狐、人和犬的机会性感染,是重要的人畜共患胞内寄生虫。E.cuniculi对蓝狐极易感染,在2013年辽宁省出现了中国首例蓝狐脑炎微孢子虫病。该病主要寄生于幼狐肾脏、脑组织,经胎盘、尿液传播,引起蓝狐大量淘汰,给蓝狐养殖业造成了巨大的经济损失,目前国内对该病报道极少,且没有相关的免疫预防措施。吉林省九台、白城和黑龙江省漠河部分蓝狐养殖场发生疑似蓝狐脑炎微孢子虫病疫情,本试验通过临床症状观察、病理剖检、PCR检测,之后对病料进行虫株纯化、染色观察、虫株分离、电镜观察以及分离株PTP1、PTP2、PTP4基因的核苷酸序列分析,为免疫诊断打下理论基础。本研究调查了吉林省九台、白城和黑龙江省漠河部分蓝狐养殖场发生的疫情,病狐表现不同程度脱水、生长停滞、眼睛失明,剖检可见肾脏苍白、肿大,将肾脏、肝脏等病料固定制备石蜡切片并进行HE染色、改良Masson三色染色、革兰染色比较观察,肾脏、肝脏等主要脏器检测到微孢子虫。根据Genebank登陆的E.cuniculi ITS1基因序列,设计特异性引物,通过提取肾脏组织DNA,克隆得到762bp的片段,经测序比对分析,确诊12例蓝狐脑炎微孢子虫病,病原为兔脑炎微孢子虫基因III型。本研究将肾脏研磨并梯度离心纯化虫体,涂片染色观察,纯化的虫体接种MDCK细胞,连续盲传至六代可观察到细胞有一定程度肿胀,虫体在细胞内一侧大量聚积,将分离得到的虫株于2万倍透射电镜下观察,虫体有多种形状,以两端钝圆的短杆状为主,虫体中间顶端部位有极丝伸出,确定分离得到的虫株为兔脑炎微孢子虫,并命名JL株。本研究根据Genbank登陆的PTP1、PTP2、PTP4基因序列。利用软件设计套式引物,通过提取DNA,套式PCR扩增分别得到1128 bp、834 bp和831bp大小的片段。将三段基因分别连接到PMD-T载体,通过PCR和双酶切鉴定后,确定三组重组质粒构建成功。对其序列与国内外经典虫株进行同源性比对,三个蛋白基因最高分别为98.7%、99.9%和98.8%,遗传进化树显示PTP1基因与国内2013年狐源分离株、美国人源分离株属于同一个分支,且与狐源分离株存在相同位点26个氨基酸序列缺失,而PTP2基因较为保守,仅有一处碱基缺失,为下一步极管蛋白应用于诊断和免疫治疗奠定基础。