犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus,CDV)是引起狐、貂、貉等毛皮动物及犬、熊猫、虎等动物犬瘟热的病原。以宠物犬来说,目前,接种疫苗是防治该病的主要措施。由于疫苗抗原性差异、高水平母源抗体或免疫犬血清抗体的干扰,往往造成免疫失败而引起犬瘟热的发生,或因血清抗体水平过低不能提供保护作用而发病。合理的免疫时机应以抗体水平检测结果为基础。临床上应用的抗体检测方法有ELISA、血清中和试验、间接免疫荧光试验等,这些方法快速、准确、便于检测大量样品。但这些检测方法操作较复杂或需要特殊仪器,可能会影响宠物犬母源抗体和免疫抗体检测的普及率。因此,定期分离CDV现地流行毒株,分析其抗原性遗传演变情况,选择抗原性一致的疫苗免疫接种;建立一种简便、经济、能够及时检测单份血清样品的CDV血清抗体检测方法,对有效预防犬瘟热具有重要意义。本研究将临床确诊为CDV病死犬的肠内容物处理液接种MDCK细胞,经传代培养后,通过电镜观察、间接免疫荧光检测、RT-PCR鉴定后确定分离获得了1株CDV,命名为CDVDN17-1。对分离毒株H基因的核苷酸序列分析结果显示,与HeB(09)3毒株H基因核苷酸同源性最高(99.8%),与临床常用CDV疫苗株Rockborn同源性最高(96.1%)。H基因系统进化树分析结果显示,与HeB(09)3毒株亲缘关系最近,属于Asia-1型。用常规疫苗免疫犬血清与分离病毒进行中和试验,结果显示,当前疫苗毒株的免疫抗体对分离病毒有中和作用。根据对CDV-DN17-1 H基因序列分析,本研究克隆了H基因两段抗原区域片段,原核表达获得了两种重组蛋白rCDV-SDH1和rCDV-SDH2,并分别免疫实验兔制备了抗血清。血清中和试验结果显示,用rCDV-SDH1制备的血清抗体中和效价为1:35,高于rCDV-SDH2制备的血清抗体,因此选择rCDV-SDH1作为凝集试验的检测抗原。经偶联条件优化,将纯化的rCDV-SDH1与红色羧化聚苯乙烯纳米微球偶联,制备了致敏免疫彩色纳米微球。以致敏微球为凝集原,CDV阳性血清为凝集素,经特异性、敏感性和稳定性试验验证,建立了CDV抗体检测间接凝集试验。通过与商品化试剂盒对血清样品的检测结果对比分析,确定了间接凝集试验的阳性判定标准,即能使致敏微球发生凝集度为“++”的血清为阳性血清。该方法具有良好的特异性,只与CDV阳性血清发生凝集反应;试剂盒检测值S≥3的阳性血清,凝集试验结果均为阳性;4℃保存1~3个月的致敏微球与阴性、阳性血清的凝集结果无变化。初步对40份临床血清样品的检测结果显示,本研究建立的间接凝集试验与试剂盒的检测结果一致。本研究从感染CDV病死犬肠内容物中分离到1株CDV,初步分析了当前流行毒株H基因的变异情况,为疫苗的选择提供了参考;建立的CDV抗体检测间接凝集试验,操作简便,特异性良好,结果易于判定,不仅可以用于大量样品的集中检测,也可以针对宠物门诊单份血清样品随时检测,便于推广应用。