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背景及目的:血管球囊成形术及支架植入术是治疗血管阻塞性疾病的重要方法,术后内膜增生(intimal hyperplasia)引起的再狭窄(restenosis)则是血管重建术后一个难以避免的问题。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)过度增殖、迁移,细胞外基质沉积等机制参与了内膜增生的过程。目前临床上应用药物洗脱球囊(Drug-eluting balloon,DEB)、药物涂层支架(Drug-eluting stents,DES)来减少血管内膜增生,其主要机制是通过支架局部缓慢释放抑制细胞过度增殖、迁移的化学药物,从而抑制血管内膜增生。但是这些药物不具备特异性,在抑制血管平滑肌细胞的同时也会影响血管内皮细胞的功能、延缓血管损伤后血管再内皮化、增加血栓形成的风险,影响患者手术预后。因此,我们需要更深入地研究血管再狭窄的机制,试图寻找新的方法减少血管内膜增生。近年来研究显示,非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)参与调控血管损伤的病理生理过程。circular RNA(circRNA)是由线性RNA通过反向拼接而成的非编码RNA。因为circRNA为闭合环状结构,不易被核酸外切酶降解,所以相对于传统线性RNA而言更稳定。circRNA通过多种途径调节基因表达,如通过分子海绵机制吸附miRNA、与RNA结合蛋白形成复合体调控下游信号通路、甚至直接编码蛋白质。已有研究表明circRNA调控血管平滑肌细胞增殖、迁移。我们检测正常的大鼠颈总动脉(common carotid arteries,CCAs)与球囊损伤侧的CCA的circRNA的表达谱发现,在球囊损伤的CCA中,circDcbld1表达量明显上升。在本课题中我们主要探索circDcbld1在球囊损伤血管中的功能及其机制,该项研究成果或许会为减少血管重建术后的内膜增生提供一种新的治疗靶点。材料与方法:1.通过球囊损伤大鼠颈总动脉内膜,建立内膜增生模型。选用12周龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,Fogarty球囊损伤左侧颈总动脉内膜,右侧颈总动脉作为假手术对照。14天后取双侧颈总动脉行circRNA芯片检测,筛选具有表达差异的circRNA并采用PCR验证。2.通过TargetScan以及miRanda databases预测circDcbld1的下游基因及生物信号传导通路。3.体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,siRNA敲低circDcbld1表达。Transwell小室迁移实验、细胞划痕实验、EdU渗入实验检测血管平滑肌细胞的迁移和增殖;western blot检测平滑肌细胞收缩表型标志蛋白SM-MHC、α-SMA、calponin表达水平。4.双荧光素酶报告基因实验验证circDcbld1与miR-145-3p及下游靶点的相互作用;RNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH)标记circDcbld1、miR-145-3p在血管组织及细胞中的空间位置;western-blot、PCR探讨circDcbld1对miR-145-3p/Neuropilin-1信号通路的调控。5.复制大鼠颈总动脉内膜损伤模型,在损伤侧CCA周围注射化学修饰的circDcbld1的siRNA,14天后检测circDcbld1表达水平和血管内膜增生情况。结果:1.球囊损伤术后颈总动脉内膜增生明显,模型建立成功。2.基因芯片结果分析显示实验组相对于对照组具有2倍以上表达差异的circRNA共有73个,38个表达上调,35个表达下调(|FC|>2,P<0.05)。其中circDcbld1上调7倍(n=3,P<0.05)。3.Transwell、细胞划痕实验证实沉默circDcbld1后,血管平滑肌细胞迁移能力下降(n=3,P<0.05),而该结果能够被miR-145-3p抑制剂逆转;EdU结果发现沉默circDcbld1后,血管平滑肌细胞增殖能力无明显差异;Western blot结果显示沉默circDcbld1后,平滑肌细胞收缩表型蛋白(SM-MHC、a-SMA、calponin)表达上升(n=3,P<0.05)。4.沉默circDcbld1后,球囊损伤导致的内膜增生明显减弱(n=3,P<0.05)。5.双荧光素酶报告基因结果显示野生型circDcbld1与miR-145-3p存在相互作用。6.RNAFISH实验表明circDcbld1与miR-145-3p均表达于血管平滑肌细胞的细胞质中,且二者位置具有重合(n=4,P<0.05)。7.野生型Neuropilin-1报告基因与miR-145-3p mimic共转染HEK293T细胞,荧光素酶活性明显减弱。而突变型Neuropilin-1报告基因与miR-145-3p mimic共转染则荧光素酶活性无明显降低。8.western blot结果显示敲低circDcbld1后,Neuropilin-1表达下降(n=6,P<0.05);使用miR-145-3p抑制剂后,Neuropilin-1表达上升(n=6,P<0.05),并且能够逆转敲低circDcbld1所致的Neuropilin-1低表达。结论:1.circDcbld1在大鼠血管新生内膜中高表达;2.沉默circDcbld1后,血管平滑肌细胞迁移能力下降,维持细胞收缩表型,显著抑制血管内膜增生,而对细胞增殖能力无明显改变;3.miR-145-3p是circDcbld1的下游靶基因,circDcbld1负向调控miR-145-3p活性;4.miR-145-3p负向调控Neuropilin-1的表达;5.circDcbld1通过miR-145-3p/Neuropilin-1轴促进血管平滑肌细胞迁移,导致血管内膜增生。