小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是危害小麦生产的重要病害之一,主要危害小麦、大麦、黑麦、水稻等禾本科作物[1]。小麦赤霉病的主要病原菌是禾谷镰刀复合种,病害流行除了造成粮食减产外,病原菌在侵染植物的过程中在病麦粒中积累的真菌毒素如单端孢霉烯族化合物和玉米赤霉烯酮也对食品安全和人畜健康造成了严重威胁[2]。基因倍增及随后发生的多拷贝基因的功能分化是基因组进化的“源动力”之一,是生物体复杂性的产生和维持、基因新功能化以及新物种进化的主要原因,在生物体不断适应环境的进化过程中具有重要作用。生物体在自然的生存选择下,其多拷贝基因为了能在基因组中得到维持,一般会避免功能冗余,或者通过分工协作共同行使祖先基因的生物学功能(sub-functionalization)[3],或者某些基因则衍生出新的生物学功能(neo-functionalization)[4]。基因倍增之后冗余功能的去冗余过程在多拷贝基因的进化过程中有着重要的意义,然而,多拷贝基因采用什么样的功能分化模式来最终实现协同分工或衍生出新功能,亦或在相当长的进化时间内继续保留冗余的功能,对这些进化机制的了解甚少。前期我们在研究禾谷镰刀菌产毒致病和抗药性机制时,发现了多组表现出功能分化的多拷贝基因[5],禾谷镰刀菌基因组中编码亮氨酸合成酶IPMD的LEU2基因存在2个拷贝,且这两个LEU2基因在不同营养条件下的表达存在差异;基因敲除试验结果显示,仅LEU2A缺失引起营养缺陷和致病力减弱,表明,Leu2a在营养代谢和侵染植物过程中起主要作用[6]。禾谷镰刀菌基因组中编码麦角甾醇合成酶甾醇14-a脱甲基酶(三唑类杀菌剂药靶)的cyp51基因存在3个拷贝,基因敲除试验结果显示,3个基因都并非菌体生长和麦角甾醇生物合成必需,在产毒致病上也存在功能冗余,然而,这3个同源的cyp51基因却在介导病原菌对三唑类杀菌剂敏感性上存在功能分化[5]。因此,研究多拷贝基因的功能分化模式对于了解新基因的起源和生命体不断适应环境的进化过程意义重大。通过生物信息学比对,从禾谷镰刀菌基因组中鉴定到在模式真菌酿酒酵母是单拷贝,但在禾谷镰刀菌中基因组中存在2个或多个拷贝的66组共154个基因,通过靶向基因敲除策略,对其生物学功能进行鉴定和分析。前期利用PCR融合方法,成功构建这154个基因的敲除载体,并利用PEG介导的原生质转化方法成功获得87个基因的敲除转化子,对这87个基因的敲除突变体进行了初步的生物学表型测定和筛选,主要包括:菌落形态、生长速度、致病性、孢子数量。本研究在采集海量生物学表型数据的基础上,挑选了其中可能在病原菌生长发育和产毒致病过程中起重要作用的8组16个基因,生物学表型测定结果显示,与其野生型菌株GZ3639相比,在完全PDA培养基中,敲除突变体在菌落形态上无差异,但有13个敲除突变体生长速率减慢;在FGA培养基中有1个敲除突变体生长的受到抑制,4个敲除突变体菌落形态不规则,4个敲除突变体生长速率慢;在植物致病性测定试验中发现,在寄主植物小麦抽穗扬花期中,发现14个敲除突变体致病能力减弱,在非寄主植物番茄中发现有9个敲除突变体致病能力减弱;在产孢能力测试中发现11个敲除突变体产孢能力减弱;表明这些基因敲除突变体在禾谷镰刀菌生长发育及致病过程中可能起到重要的作用。致病性试验中只有编码双加氧酶的双多拷贝基因FGJLP1出现功能分化,FgJLP1a-1基因敲除后致病能力未发生变化,而FgJLP1b-1基因敲除后致病力减弱。