乳酸是自然界中应用最为广泛的天然有机酸,同时也是可降解高分子材料聚乳酸的前体物质。近年来,随着人们对生态环境的保护意识日益增强,极大地带动了聚乳酸行业的发展,进而扩大了市场对高质量乳酸的需求。拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)作为一株潜在的工业乳酸生产菌,前期研究表明其具有高效的L-乳酸生产能力,但生成的产物中仍含有少量D-乳酸,从而使L-乳酸的光学纯度达不到聚乳酸级别(>99.0%)。本研究通过建立拟干酪乳杆菌CRISPR/Cas9基因编辑平台,成功将高转录水平的ldhL1基因替换出发菌株中的ldhD基因,从而获得一株高效生产高质量L-乳酸的生产菌株,并对其在高糖浓度下发酵的生理代谢特性进行初步分析。首先,对拟干酪乳杆菌电转条件进行优化,确定了适用于拟干酪乳杆菌的最佳转化方法,使得转化效率可以达到104(CFU/μg DNA)以上。通过RT-PCR对拟干酪乳杆菌中存在的三个乳酸脱氢酶基因(ldhL1、ldhL2和ldhD)进行相对转录水平分析,确定以高转录水平的ldhL1基因为表型基因,构建CRISPR/Cas9基因编辑系统,从而实现拟干酪乳杆菌的高效编辑。其次,探究环境因素中温度、pH对拟干酪乳杆菌生产L-乳酸光学纯度的影响,发现在温度在37℃,pH为6时有最佳光学纯度(95.0%左右),但这种环境调控无法有效提高L-乳酸光学纯度。通过CRISPR/Cas9基因编辑方法将ldhD基因替换为ldhL1基因,获得一株高质量L-乳酸生产菌株。通过摇瓶发酵分析,突变株L-乳酸的光学纯度从原来的95.2%提高到99.0%,生产速率由原来的1.65 g/L/h提高到1.86 g/L/h,转化率从83.2%提高到 93.0%。最后,将ldhL1过表达突变株与出发菌株进行初始葡萄糖浓度为130 g/L的5 L发酵罐实验,分析对比两株菌的发酵特性,并且通过拟合生长动力学和生产动力学曲线得出,突变株最大比生长速率μm从0.440 h-1提高到0.497 h-1,生长相关系数α从7.46 g/g提高到8.20 g/g,表明拟干酪乳杆菌乳酸生产是一个与生长非常相关的过程,并且在突变株中其相关型更加紧密。此外,通过高糖浓度(200g/L)发酵,结果表明突变株拥有更快的细胞生长速率,从而持续高效生产L-乳酸,生产速率和转化率相对于出发菌株分别提高了 3 7.0%和9.3%,L-乳酸的光学纯度从95.2%提高到99.0%,而且胞外副产物乙酸含量明显减少,从而使得突变株不但拥有高光学纯度,而且其化学纯度也达到99.0%以上。通过对比文献报道中优良性能乳酸生产菌的关键性能指标参数,本课题构建的突变株不但在耐初糖浓度、乳酸产量、乳酸转化率上具有良好的可比性,而且乳酸产率要远远高于文献报道值,从而使其成为一株具有巨大应用潜力的工业乳酸生产菌株。