人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)在体外可以维持稳定自我更新,是能够分化产生所有类型成体细胞的多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)。通过体外定向分化产生各种不同类型的细胞,可为细胞替代治疗提供潜在的细胞来源,在再生医学应用方面拥有巨大的发展前景。脊髓作为中枢神经系,具有上下传导神经信号、神经信号整合、协调运动等多种功能。肌萎缩性脊髓侧索硬化、神经性肌肉萎缩等脊髓退行性病变以及外源性创伤都将导致脊柱损伤,目前的手术、药物治疗方式对脊髓损伤的治疗效果有限,细胞移植有望成为脊髓损伤治疗的新手段。神经中胚层祖细胞(neuromesodermal progenitors,NMPs)不仅可以分化为脊髓中的神经细胞,而且还可以产生脊髓周边的中胚层组织,在脊髓损伤的细胞治疗中具有独特的应用价值。目前已经建立了较为成熟的诱导手段,将人PSCs分化为SOX2和T阳性的NMPs,但是如何实现NMPs的自我更新仍是有待解决的问题。本论文遵循体内发育线索,通过使用双重Smad抑制,同时激活WNT和FGF信号通路,成功获得了可以稳定自我更新的NMPs(self-renewing neuromesodermal progenitors,srNMPs)。该细胞共表达神经标志基因SOX2和中胚层标志基因T,同时还表达神经干细胞标志基因NESTIN、NCAD、CD133,增殖标志基因MKI67以及HOX家族基因HOXB8、HOXB9,验证了其脊髓后端神经干细胞的特征。srNMPs可在体外稳定传代超过30代,并维持细胞表型的稳定。在不添加任何形态发生素的神经分化条件下,srNMPs细胞分化产生vGLUT2、TACR1、SST、PAX2、HOXB8、HOXB9阳性的脊髓V0_G神经元。添加SHH、RA进行腹侧化诱导一周,srNMPs细胞被诱导为OLIG2阳性的运动神经前体细胞,神经分化三周后可产生共表达ISL1、ChAT、vAChT的运动神经元。激活WNT、BMP4进行背侧化诱导一周,再经过三周的神经分化,srNMPs细胞可分化为ATOH1、PAX3、PAX7阳性的脊髓dl1区中间神经元。该结果说明了srNMPs细胞可响应背腹轴信号的诱导,从而分化产生脊髓不同背腹轴定位的神经元。NMPs不仅是脊髓的前体细胞,而且是临近的轴旁中胚层(paraxial mesoderm)的前体细胞,轴旁中胚层主导了体节的形成,可进一步分化为软骨、骨骼肌、骨和真皮等中胚层组织。目前对NMPs的鉴定主要基于SOX2和T的共表达和向脊髓神经细胞的分化,NMPs在体外向中胚层细胞的分化尚有待验证。为了进一步证明srNMPs的中胚层分化潜能,我们通过单克隆分化、悬浮培养成球分化和体内肾包膜移植等实验来证明srNMPs具有神经和中胚层双向分化潜能。单克隆形成实验中,单个srNMPs细胞形成的克隆可在N2B27基础培养基中自发分化,可产生α-SMA阳性的中胚层细胞和MAP2阳性的神经元。同样,srNMPs也可在肾包膜下可分化成α-SMA阳性的中胚层组织和MAP2阳性的神经组织。悬浮培养实验中,srNMPs细胞成球后自发分化,可产生包含神经组织、软骨组织、肌肉组织的复杂结构,类似于胚胎发育过程中的脊柱。以上结果进一步证明了srNMPs细胞是神经中胚层祖细胞,具有中胚层和神经外胚层的双向分化潜能。本论文还对NMPs的发育起源及机制进行了一些探讨:1.使用小分子抑制剂SB431542、DMH1、LGK974分别抑制TGFβ、BMP、WNT信号通路,可将hESCs诱导成FOXG1阳性的前端神经上皮细胞,但是再激活WNT和FGF信号通路时,其无法转变为NMPs,从而证明了NMPs和前端神经外胚层细胞具有不同的发育起源。2.过表达FOXG1的细胞可以被成功诱导为NMPs,证明了前端神经外胚层细胞无法被诱导为NMPs的关键基因并非是FOXG1。3.有文献报道,SP8敲除小鼠的脊柱发育异常,所以本研究通过CRISPR/Cas9技术获得SP8敲除的hESCs,但是该细胞仍可被成功诱导为NMPs,证明了SP8不是NMPs诱导过程的关键基因。4.有报道证明,NMPs细胞中调控SOX2表达的增强子原件与ESCs、神经上皮细胞不同,NMPs细胞的SOX2的表达受增强子N1调控,ESCs和神经上皮细胞的SOX2的表达受增强子N2调控。通过甲基化测序检测,人的ESCs、NE及NMPs的SOX2增强子N1、N2中的甲基化状态,检测其是否存在差异。检测结果显示SOX2的增强子N1、N2的甲基化位点基本上没有发生甲基化现象,所以SOX2的增强子N1、N2的表达活性差异并非通过甲基化调控实现。综上,本研究成功获得了可以稳定自我更新的NMPs,该细胞共表达基因SOX2和T,可在体外稳定传代超过30代并维持细胞表型的稳定,具有脊髓神经干细胞的分子特征,能响应背腹轴信号分化产生脊髓背侧、腹侧神经元,并能在多种细胞分化实验中均能产生神经和中胚层细胞。悬浮培养的NMPs自发分化后形成包含神经组织、肌肉和软骨组织的细胞团,类似于发育中的脊柱。本课题建立的自我更新的NMPs有望在脊柱损伤的细胞治疗和NMPs细胞分化命运选择的机制研究中具有重要的应用价值。