[目的]缺氧缺血性脑损伤（HIBD）是新生儿致死致残的首要原因,30%的幸存患儿会遗留神经系统后遗症,但发病机制不清。突触是信息传递的核心,突触损伤为HIBD患儿行为异常的关键机制。髓系细胞是指由髓系前阶段幼稚细胞分化的所有髓细胞,在广义上包括粒系细胞、红系细胞、巨核系细胞以及单核系细胞,在脑内主要为小胶质细胞（MGs）及外周入侵的单核细胞（MDMs）。由髓系细胞活跃带来的神经炎症是HIBD发生的核心机制之一。吞噬和炎症是髓系细胞（MGs及MDMs）的主要功能,并籍此调控突触可塑性。生理情况下,发育脑内吞噬与炎症维持在一定的水平,“吞噬-炎症”平衡将帮助形成稳定的神经环路。病理情况下,“吞噬”和/或“炎症”功能失去原有稳态,出现激活或抑制,不再保有平衡状态,此为“吞噬-炎症”失衡。除了吞噬和炎症功能,目前的研究认为MGs和MDMs作为脑内最重要的免疫细胞,生理情况下可通过吞噬及炎症功能参与调控突触修剪,从而参与神经环路形成;病理情况下,它启动脑内炎症反应,还可通过吞噬作用对微环境稳态的损伤及修复发挥作用。HIBD后脑内“吞噬-炎症”出现失衡,它在HIBD所致突触损伤中的发病机制,及其分子机理尤其是可能的调控还有待进一步研究。我室的前期研究证实,HIBD后除MGs活化外,MDMs亦入侵脑实质,MGs炎症及吞噬功能活跃,但二者与突触损伤修复的关系尚不清楚。据此本课题拟从髓系细胞（MGs及MDMs）在HIBD所致“吞噬-炎症”失衡的角度入手,重点研究它们在突触损伤、修复中的作用,试揭示HIBD后两种髓系细胞“吞噬-炎症”失衡在HIBD后突触损伤中的作用机制及其可能的调控。[方法]1.采用CX3CR1GFP/+CCR2RFP/+双转基因小鼠及C57BL/6J小鼠通过改良的Rice-Vannucci法建立新生鼠HIBD模型,以进一步确认两种不同髓系细胞的功能。随机将动物分为假手术组（Sham）及缺氧缺血组（HI）,其中缺氧缺血组依据前期研究又进一步分为缺氧缺血轻度损伤组（HIM）、缺氧缺血重度损伤组（HIS）。2.行为学实验明确HIBD后6 w小鼠的行为学改变。3.TTC染色确认HIBD后3 d小鼠脑梗死范围。4.HE染色揭示HIBD后3 d及6 w小鼠的脑组织形态学改变。5.尼氏染色评估HIBD后3d及6 w的小鼠脑神经元损伤。6.Tunel染色评估HIBD后3 d的小鼠脑细胞的凋亡。7.FJB染色评估HIBD后1 d及3 d脑组织神经元的损伤。8.Western Blotting 检测 HIBD 后 3 d 突触相关蛋白（PSD95 及 SYP）、TREM2 的表达,以及OGD前后MGs细胞系BV2突触后膜蛋白表达的改变。9.免疫荧光技术检测HIBD后3 d脑内两种髓系细胞在脑皮层及海马的活跃情况,及其与突触相关蛋白间的关系。10.免疫荧光技术检测HIBD后3 d脑内CD11b+细胞LAMP1、PSD95的表达。11.利用两种髓系细胞系（MGs细胞系-BV2,单核巨噬细胞系-Raw264.7）进行吞噬刺激实验,检测两种髓系细胞在糖氧剥夺（OGD）前后吞噬能力的变化。12.磁珠分选结合的流式细胞学实验检测HIBD后3 d脑内两种髓系细胞TREM2及CD200R的表达。13.免疫荧光技术检测HIBD后3 d脑内两种髓系细胞TREM2及其衔接子DAP12和促炎因子IL-1β、IL-6的表达。14.免疫荧光技术检测炎症因子（IL-1β、IL-6）刺激后,原代MGs分泌PSD95蛋白的情况。[结果]1.验证HIBD后脑损伤情况（1）HIBD后行为学改变a.旷场实验结果证实HIBD后6 w各组小鼠的运动功能未受到明显损害,但HIM组小鼠在旷场实验检测的10-15 min时间段以及20-25 min时间段内,其在中间区域停留时间较Sham组小鼠增加。b.黑白箱实验结果证实HIBD后6 w,HIM及HIS组小鼠在黑箱与白箱之间的穿梭次数减少。（2）HIBD后脑组织病理学异常a.HIBD后3 d,HIS组小鼠脑组织出现明显梗死灶,Sham组及HIM组均未见到明显梗死灶。b.HIBD后3d,HIS组小鼠脑皮层及海马区域质地疏松、染色变浅、可见噬元现象,可见局灶性巨噬细胞、MGs和少量中性粒细胞浸润,部分细胞出现典型坏死,HIM组小鼠脑组织形态学未见明显改变;HIBD后6w,HIS组海马CAI、CA2、CA3区均可见组织结构破坏、细胞数量减少、神经元丢失;HIM组小鼠海马CAI区域细胞变少,部分神经元丢失。（3）HIBD后神经元受损a.HIBD后3d,HIS组小鼠脑皮层及海马区域尼氏小体数量减少、染色变浅;HIM组小鼠脑内尼氏小体数量及颜色深浅未见明显改变;HIBD后6 w,HIS组小鼠海马CAI、CA2、CA3区均可见尼氏小体数量减少、染色变浅;HIM组小鼠脑组织海马CAI区域尼氏小体数量减少,染色变浅。b.HIBD后3d,HIS组小鼠脑皮层及海马CA1、CA2、CA3区域出现大量凋亡细胞,且以皮层及CA2区域最为严重,海马齿状回未见凋亡细胞。c.HIBD后1 d及3 d小鼠脑皮层及海马CA2区域有大量急性坏死的神经元。2.验证HIBD后突触受损情况（1）突触的丢失及清除:HIBD后突触丢失增多,MGs为吞噬突触的髓系细胞a.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马部位神经元标记物-NeuN的表达下降,突触素蛋白SYP的表达未见明显变化,突触后膜蛋白PSD95表达增高。b.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区域梗死灶中心及边缘区域突触后膜蛋白PSD95表达增高并与MGs共定位;HIM组皮层及海马CA2区域突触后膜蛋白PSD95的表达未见明显变化。c.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区域突触素蛋白SYP的表达在梗死灶中心区域出现下降,在梗死灶的边缘区域均出现增高,且主要与MGs共定位;HIM组皮层及海马CA2区域突触素蛋白SYP的表达出现增加。（2）MGs表达突触蛋白a.HIBD后3 d,Sham及HIM组PSD95散在分布在MGs周围,未观察到脑实质内存在MDMs,MGs胞体较小,突起较长,分支较多,分支及胞体内部分可见PSD95。HIS组皮层及海马PSD95表达增多,MGs胞体变圆,突起缩短,胞体内存在有大量PSD95,部分可沿着胞膜分布,MDMs主要存在于梗死的中心区域,但不与PSD95接触。b.HIBD后3d,Sham及HIM组SYP呈现厚厚一层,铺在MGs胞体一端,未观察到脑实质内存在MDMs,MGs胞体较小,突起较长,分支较多,分支及胞体内部分可见SYP。HIS组皮层及海马SYP依旧是厚厚一层,但并不是铺在MGs胞体一端,而是横贯铺在MGs胞体中间,MGs胞体变圆,突起缩短,部分细胞的突起几乎不可见,胞体内存在有少量突触素蛋白SYP,MDMs主要存在于梗死灶的中心区域,但几乎不与突触素蛋白SYP接触。c.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马区域,CD11b+细胞内部分突触后膜蛋白PSD95与溶酶体蛋白1 LAMP 1共定位,部分未与LAMP 1共定位。d.OGD后0 h,MGs细胞系PSD95的表达明显增加,OGD后24 h恢复到OGD前水平。e.OGD后0h,原代MGs其PSD95的表达出现增多,仅炎症因子IL-6刺激后,在正常培养条件下,MGs分泌PSD95较未加炎症因子刺激组出现增多,OGD后MGs分泌PSD95蛋白的水平进一步增高,均高于炎症刺激后的正常培养组。3.HIBD后脑内“吞噬-炎症”失衡（1）HIBD后吞噬活跃,MGs主要执行吞噬突触的功能a.HIBD后3d,HIS组皮层及海马部位TREM2表达增加。b.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马实质均可见到外周血单核细胞（MDMs）浸润。c.正常培养条件及糖氧剥夺（OGD）后,小鼠MGs细胞系-BV2的吞噬能力始终强于单核巨噬细胞系-Raw264.7;OGD后BV2细胞始终保持很强的吞噬能力,但Raw264.7细胞系的吞噬能力下降。（2）HIBD后炎症反应活跃,MGs与MDMs均表达炎症介质,但仅MDMs表达 IL-6a.HIBD后3 d,HIS组皮层梗死灶边缘区MGs与MDMs促炎因子IL-1β水平增高;HIM组皮层IL-1β水平未见明显变化;HIS组海马CA2区梗死灶边缘及中心区MGs与MDMs促炎因子IL-1β水平增高;HIM组海马MGs与MDMs促炎因子IL-1β水平下降。b.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区域梗死灶中心区MDMs促炎因子IL-6水平增高,梗死灶边缘区MDMs促炎因子IL-6水平出现下降;HIM组皮层MDMs促炎因子IL-6水平未见明显变化,但HIM组海马MDMs促炎因子IL-6水平出现下降。各组别未见MGs表达IL-6。4.HIBD后脑内“吞噬-炎症”失衡可能的调控机制a.HIBD后3 d,HIS组脑皮层内MGs表达TREM2及CD200R均增加,但MDMs上二者的表达未见明显变化;HIM组中仅MDMs表达CD200R出现增加。b.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区域梗死灶中心及边缘区MGs表达TREM2增高;HIM组皮层及海马CA2区域MGs表达TREM2未见明显变化;各组别MDMs未见TREM2表达。HIS组皮层及海马CA2区梗死灶中心及边缘区的MGs、MDMs表达TREM2衔接子DAP12增高;HIM组皮层及海马CA2区MGs、MDMs表达TREM2衔接子DAP 12未见明显变化。c.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区梗死灶中心区PSD95、TREM2、DAP12表达出现增加,放大到600X后,可见有部分细胞可以共表达TREM2、PSD95以及DAP12,但具体细胞类型还有待进一步研究。[结论]1.HIBD后脑内神经元及突触受损,MGs为脑内执行突触吞噬的髓系细胞,可表达吞噬蛋白TREM2,TREM2可能参与调控HIBD后MGs及MDMs吞噬活动。2.MG可吞噬及分泌突触后膜蛋白PSD95,炎症因子（IL-6及IL-1β）均可刺激MGs 表达 PSD95。3.MGs与MDMs均可释放炎症因子IL-1β,但MDMs的炎症反应更强烈并主要表达IL-6,且其释放的IL-6对MGs的吞噬功能可能具有调控作用,CD200R参与调控MGs及MDMs炎症释放。