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研究目的乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是一种嗜肝DNA病毒,全球约有4亿HBV携带者,HBV感染可引起急性、慢性和重型肝炎,并与肝纤维化、肝硬化和肝癌的发生密切相关。HBV被认为是一种"隐匿性病毒",在感染早期能够逃避机体免疫监视,HBV可产生多种病毒相关蛋白以抑制机体天然和适应性抗病毒免疫应答,导致病毒在体内长期存在。NLRP3炎症小体(inflammasome)是一种存在于胞浆中的大分子多蛋白复合体,能够感知病原微生物感染、组织损伤和代谢失衡时所释放的分子信号,促进IL-1β和IL-18等炎性因子的成熟和释放。NLRP3炎症小体的活化需要双信号:第一信号(预刺激信号)由病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern,PAMP)诱导产生,通过活化NF-κB信号通路而促进NLRP3和pro-IL-lp的表达;第二信号(活化信号)由危险相关分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMP)诱导产生,通过活化caspase-1促进IL-1β等细胞因子的成熟和分泌。IL-1β作为一种多效炎症因子,能够促进多种免疫相关基因的表达,并募集淋巴细胞至感染部位,抑制包括HBV在内的多种病原微生物感染。研究表明,多种病原微生物可通过各种机制抑制NLRP3炎症小体的活化,进而逃逸机体的免疫应答。但是HBV感染与NLRP3炎症小体活化之间的关系尚不清楚。肝脏是人体最重要的代谢和解毒器官,来自肠道中的细菌成分(如LPS)可通过门静脉进入肝脏,导致肝脏中NLRP3炎症小体的活化和促炎因子的产生,而肝脏又是HBV的主要感染器官,那么HBV能否通过影响肝内NLRP3炎症小体的活化而促进自身的免疫逃逸?为了探讨这一问题,在本研究中,我们首先利用HBV体内外感染模型证实HBV自身并不能活化NLRP3炎症小体;进而通过给予LPS诱导肝组织中NLRP3炎症小体的活化,发现肝脏Kupffer细胞是表达NLRP3炎症小体和分泌IL-1β的主要细胞,而HBV感染可明显抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化;继而利用体外细胞模型、HBeAg突变小鼠模型和临床HBV慢性感染及肝癌患者标本证实HBV分泌的HBeAg介导了对NLRP3炎症小体活化的抑制作用,并深入探究了其作用机制;最后,在鼠伤寒感染模型中进一步验证了 HBV对NLRP3炎症小体活化的抑制作用。研究方法1.通过Real-time PCR和Western blotting技术检测HBV稳定表达细胞系、HBV感染小鼠及临床HBV患者肝组织中NLRP3炎症小体及活化相关分子的表达。2.通过尾静脉高压注射pAAV/HBV1.2或pAAV/HBV1.2-e-null质粒至C57BL/6小鼠体内,建立HBV感染小鼠模型或HBV-e-null小鼠模型。3.通过ELISA检测小鼠血清中HBsAg和HBeAg水平;通过免疫组化检测肝组织原位HBcAg表达;通过荧光定量PCR检测HBV DNA含量。4.通过流式细胞术和免疫荧光技术检测Kupffer细胞中IL-1β的表达。5.通过流式细胞术和Western blotting检测细胞中NF-κB的活化。6.利用ZDOCK 3.0.2程序对HBeAg与TRAM、MAL分子进行模拟对接。7.通过ELISA检测细胞培养上清、血清或肝脏研磨液中IL-1β、IL-18和IL-6的水平。8.通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测DCF的荧光强度以检测ROS产生。9.通过Western blotting检测细胞膜上p47-phox和Na+/K+ ATPase的表达。10.通过激光共聚焦显微镜分别观察胞浆中Fluo-3/AM和溶酶体中LysoTracker的荧光强度以检测细胞中Ca2+水平和溶酶体稳定性。11.用鼠伤寒沙门氏菌分别感染HBV慢性感染小鼠和对照小鼠后,通过检测肝脏组织中鼠伤寒沙门氏菌的载量和小鼠生存期,以确定小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染的敏感性。实验结果1.HBV感染不能活化NLRP3炎症小体HepG2.2.15 细胞中 NLRP3、pro-caspase-1 和 pro-IL-1β等 NLRP3 炎症小体相关分子的表达水平显著低于HepG2细胞;体外用LPS和不同浓度的HBV颗粒刺激分化后的THP-1细胞不能活化NLRP3炎症小体;与对照小鼠相比,急性和慢性HBV感染小鼠的肝组织中NLRP3炎症小体相关成分及血清中IL-1β表达均未见明显升高。2.HBV能够抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化HBV慢性感染可显著抑制LPS诱导的小鼠肝组织中NLRP3和pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化以及IL-1β的成熟;肝脏中的巨噬细胞是表达NLRP3炎症小体和分泌IL-1β的主要细胞,并且HBV主要抑制小鼠肝脏Kupffer细胞中IL-1β的表达;用含HBV成分的培养上清孵育分化的THP-1细胞能够显著抑制细胞中LPS诱导的NLRP3和pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化以及IL-1β的分泌。以上结果说明,HBV对LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化有抑制作用。3.HBeAg,而非HBsAg,具有抑制NLRP3炎症小体活化的作用HBeAg预孵育可显著抑制LPS诱导的THP-1细胞中的NLRP3和pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化以及IL-1β的成熟;体内实验显示,HBV慢性感染可显著抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体活化,但是在HBeAg缺失的HBV慢性感染小鼠中,HBV对炎症小体的抑制作用减弱;HBeAg不但可以抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化,还能抑制其它活化剂诱导的该炎症小体的活化。HBsAg预孵育与否并不影响LPS诱导的THP-1细胞中NLRP3炎症小体的活化。以上结果说明,对NLRP3炎症小体发挥抑制作用的是HBeAg,而不是HBsAg。4.HBeAg通过抑制NF-κB的活化抑制NLRP3和pro-IL-11的表达HBeAg预孵育分化的THP-1细胞,可显著抑制LPS诱导的NF-κB的活化水平和下游细胞因子IL-6和TNF-α的表达。利用ZDOCK 3.0.2程序对HBeAg和NF-κB信号通路下游的两个接头分子TRAM和MAL进行模拟对接,发现HBeAg和这两个分子均存在结合区域。说明HBeAg有可能通过与TRAM和MAL分子结合而抑制NF-κB的活化。5.HBeAg通过抑制ROS产生抑制NLRP3炎症小体的活化HBeAg预孵育分化的THP-1细胞,可显著抑制LPS诱导的NADPH氧化酶的活化,进而抑制ROS的产生;外加H2O2后,HBeAg对NLRP3炎症小体的抑制作用明显降低。6.HBeAg+的临床HCC和CHB患者体内NLRP3炎症小体的活化被抑制HBeAg+的 HCC 患者癌旁组织 NLRP3、活化的 caspase-1 p20、pro-IL-1β和成熟的IL-1β p17的表达水平显著低于HBeAg-患者。同样,HBeAg+的HCC患者肝组织Kupffer细胞中IL-1β水平明显低于HBeAg-患者。免疫耐受期(HBeAg+)CHB患者血清IL-1β水平较低,而部分免疫非活化期(HBeAg-)患者血清IL-1β水平较高。除HBeAg外尚有其它因素对炎症小体的活化和IL-1β的表达产生影响。7.HBV慢性感染小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染更加敏感与对照小鼠相比,HBV慢性感染小鼠在感染鼠伤寒沙门氏菌后,体内NLRP3和pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化以及IL-1β的分泌更低,肝组织的细菌载量更高,生存期更短。说明HBV可能通过降低NLRP3炎症小体的活化和IL-1β的表达增加小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染的敏感性。结论及意义1.本研究发现Kupffer细胞是肝脏中表达NLRP3炎症小体和产生IL-1β的主要细胞。2.本研究首次发现HBV本身不能活化NLRP3炎症小体,但可以通过HBeAg抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化和IL-1β等促炎因子的产生,从而抑制机体的抗病毒免疫应答,有利于HBV在体内的存活和慢性感染状态的形成。3.本研究首次阐明HBeAg抑制NLRP3炎症小体的两个途径:既通过抑制NF-κB信号通路抑制NLRP3和pro-IL-1 β分子的表达,又通过抑制ROS抑制caspase-1的活化和IL-1β的成熟。4.本研究首次发现HBV可通过抑制肝脏NLRP3炎症小体活化而抑制炎症反应并阐明了其主要分子机制,揭示了 HBV免疫逃逸的一种新方式,为治疗HBV慢性感染及相关疾病提供新的策略。