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随着纳米技术的不断发展,纳米氧化锌(zinc oxide nanoparticles,ZnO NPs)由于其优异的理化特性,被广泛的应用于各个领域,人类暴露于ZnO NPs的机率也大大的增加了。纳米颗粒可经由嗅球-大脑转运途径和血脑屏障-中枢神经系统途径进入大脑,在大脑中逐渐积累从而损坏神经细胞和脑功能,造成永久性脑损伤。小胶质细胞被认为是脑内的“巨噬细胞”,是大脑内的常驻免疫细胞,对微环境的变化很敏感,当大脑受到外界刺激和损伤时会被激活。活化的小胶质细胞可递呈抗原和分泌细胞因子,构成中枢神经系统抵御病原体入侵的第一防线。因此,对小胶质细胞的炎症反应进行评价及研究其炎性作用机制,对于ZnO NPs的生物安全性风险评估具有重要意义。本研究通过体外实验研究,以期了解ZnO NPs材料对小胶质细胞可能造成的炎症损害作用及其作用机制,为评价ZnO NPs的安全性提供敏感的评价指标及理论依据。实验共分为三部分,内容如下:第一部分ZnO NPs的表征研究目的:通过对ZnO NPs进行表征,为ZnO NPs后续研究提供基础。研究方法:通过投射电镜(TEM)观察ZnO NPs颗粒的粒径和形状;ZnO NPs悬液的Zeta电位和水合粒径使用马尔文粒径分析仪测量。研究结果:TEM研究观察果显示ZnO NPs球形,分散较均匀,部分颗粒团聚现象,平均粒径约为61.84?18.51 nm。马尔文粒径分析仪测得培养基分散的ZnO NPs颗粒的平均水合粒径为220.83±9.11nm,Zeta电位是-17.87±0.58mV,分散系数PDI为0.11±0.074。第二部分ZnO NPs对小胶质细胞炎症因子分泌的影响研究目的:探讨ZnO NPs对BV2小胶质细胞炎症损伤的影响。研究方法:1.不同浓度ZnO NPs(5.0,10.0,15.0,20.0,30.0,50.0,75.0μg/mL)染毒小鼠小胶质瘤细胞(BV2细胞)24h,并设立对照组(未施加任何干预)。用噻唑蓝比色(MTT)法测定细胞存活率,确定染毒浓度;2.以ZnO NPs(0,5.0,10.0,15.0,20.0ug/mL)染毒处理24h,用比色法检测上清中乳酸脱氢酶(LDH)水平以判断细胞膜的完整性;3.采用ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的分泌水平。研究结果:1.MTT结果显示,在不同浓度ZnO NPs干预下,BV2细胞存活率随ZnO NPs染毒浓度的增加而降低(P<0.05)。2.与对照组相比,ZnO NPs染毒组LDH水平增加,差异有统计学意义(P<0.05)。3.与对照组相比,ZnO NPs染毒组TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平增加(P<0.05),且在一定剂量范围内呈剂量-效应关系。第三部分ZnO NPs对p38 JNK MAPK和JAK2/STAT3信号通路的影响研究目的:探讨p38 JNK MAPK和JAK2/STAT3信号通路在ZnO NPs诱导BV2细胞产生炎症因子中的作用。研究方法:1.Western Blot法测定不同浓度ZnO NPs(0,5.0,10.0,15.0,20.0μg/mL)干预下,及同浓度ZnO NPs不同时间段(0,0.5,1,1.5,3h)p38MAPK,p-p38MAPK,JNK,p-JNK、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白变化情况。2.Image J对蛋白条带灰度值进行分析。应用相关分析法分析炎症因子分泌与p38MAPK,JNK,JAK2,STAT3蛋白磷酸化水平的相关情况。3.设立对照组(不施加任何处理),抑制剂对照组,ZnO NPs处理组,SB203580抑制剂+ZnO NPs共同处理组,SP600125抑制剂组+ZnO NPs共同处理组,AG490+ZnO NPs共同处理组(ZnO NPs干预前30min加抑制剂)。采用Western Blot测定分别测定各组p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白变化情况及ELISA测定炎症因子分泌水平。研究结果:1.WB条带图显示,随ZnO NPs染毒浓度的增加,p38MAPK、JNK、JAK2、STAT3蛋白磷酸化蛋白表达水平增加。p-p38MAPK/p38MAPK、p-JNK/JNK、p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3灰度值比值与对照组相比,灰度值比值增高,差异有统计学意义(P<0.05),且与炎症因子分泌水平相一致。2.WB结果显示,随着染毒时间的增加,p38MAPK、JNK、JAK2、STAT3磷酸化蛋白表达水平,在一定时间内表达水平上升。其中p-JNK以1.5h表达水平最为明显。p38MAPK蛋白磷酸化水平在1.5h时开始变化。p-JAK2及p-STAT3蛋白表达水平在ZnO NPs干预1h后开始变化,其中p-JAK2以1.5h蛋白表达水平变化最为明显,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。3.SB203580及SP600125能分别有效抑制ZnO NPs诱导的p38MAPK和JNK蛋白磷酸化水平,差异均有统计学意义(P<0.05);JAK2抑制剂AG490能抑制ZnO NPs所致BV2细胞p-JAK2蛋白表达水平,同时能有效抑制其下游通路p-STAT3蛋白表达水平。4.抑制剂SB203580,SP600125及AG490能够抑制ZnO NPs所致的炎症因子分泌水平,差异有统计学意义(P<0.05)。研究结论:ZnO NPs可诱导BV2细胞炎症因子分泌水平升高及p38MAPK、JNK、JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平增高,p38 JNK MAPK,JAK2/STAT3信号通道在ZnO NPs诱导的BV2细胞炎症因子分泌中具有重要作用。