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迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种重要的鱼类病原菌,由它引起的迟钝爱德华氏菌病对海水鱼和淡水鱼都具有很高的致死率。为了及时采取有效措施控制迟钝爱德华氏菌病的暴发,迫切需要建立便捷、准确的方法对E. tarda早期感染进行快速准确的诊断。本课题制备了E. tarda单克隆抗体和多克隆抗体,并用其制备了E. tarda检测试纸条,同时将此方法与斑点杂交和环介导等温扩增方法进行了比较。用柠檬酸还原氯金酸的方法制备了各种不同粒径的胶体金溶液,并用可见光谱和透射电镜评价了胶体金溶液的分散性、形状以及粒径分布。选择粒径为30 nm的胶体金颗粒标记E. tarda多克隆抗体,并将其吸附至玻璃纤维素膜上,将E. tarda多克隆抗体和羊抗兔二抗包被于分析膜上预定的检测线(T)和质控线(C)上,然后将金标垫、样品垫、分析膜以及吸水垫组装成检测试纸条。该试纸条对E. tarda特异性良好,检测三株E.tarda均为阳性结果,与其他环境常见细菌无交叉反应。该试纸条检测限为107CFU/ml(3-10 min内),延长反应时间后可达到105 CFU/ml。自渔场采集疑似罹患迟钝爱德华氏菌病的大菱鲆腹水,以试纸条检测结果为阳性,同时采用传统生理生化和16S rDNA测序鉴定该大菱鲆确为E. tarda感染,且腹水中该菌浓度为5×105CFU/ml.为提高检测试纸条的灵敏度,制备了E. tarda单克隆抗体。提取E. tarda外膜蛋白,并用其免疫Balb/c小鼠。经三次免疫后,选择血清中抗体ELISA效价较高的两只小鼠,制备分散的脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞进行两次融合。经过筛选和克隆,获得了两株能够稳定分泌具有良好特异性和亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将这两株杂交瘤经培养后,注入小鼠腹腔产生腹水。抽取的腹水经蛋白G亲和纯化得到E. tarda单克隆抗体。经亚型鉴定分析,二者均为IgG2a。经抗体匹配实验后,用胶体金颗粒标记E. tarda单克隆抗体,并将其吸附至玻璃纤维素膜上,将单克隆抗体和羊抗鼠二抗包被至分析膜上预定的检测线(T)与质控线(C),然后将金标垫、样品垫、分析膜和吸水垫组装成检测试纸条。经过优化后,该检测试纸条的灵敏度达到5×105 CFU/ml,3～10 min内即可观察结果,特异性良好,与其他海水及鱼类常见细菌无交叉反应,检测20株E. tarda,阳性检出率为100%。为评价所制备的检测试纸条的性能,将试纸条检测方法与斑点杂交和环介导等温扩增方法进行了比较。试纸条的检测限(5×105 CFU/ml)虽高于斑点杂交(1×1O5 CFU/ml)口环介导等温扩增(1×103CFU/m1),但是试纸条检测方法方便快捷,可于样品采集现场进行检测操作,不需要处理其他试剂和昂贵的仪器设备,在3-10 min即可获得检测结果。因此,该试纸条可用于养殖渔场现场检测E. tarda发病情况,以便及时采取有效措施减小和避免造成巨大经济损失。