论文部分内容阅读
血管新生参与很多生理与病理过程,其在心血管疾病的发生发展(如冠状动脉粥样硬化病理性滋养血管的形成)和治疗(如心肌梗死时缺血组织血管新生)中发挥重要作用。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)是重要的体液调节系统,而血管紧张素II (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)是该系统的重要生物活性肽。研究发现,AngⅡ促进血管生成。Rho蛋白参与调节细胞的多种生命过程,家族分子RhoA与其下游效应分子Rho激酶(Rho associated kinase, ROCK)是细胞内信号转导通路的重要成分,在Ang Ⅱ的作用下可有效激活。近来,研究发现RhoA/ROCK及其下游促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路参与调控血管生成。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一类能增殖和分化为血管内皮细胞、但尚未表达成熟血管内皮细胞表型的前体细胞。大量研究表明,EPCs不仅参与血管形成(angiogenesis),同时也参与出生后血管发生(vasculogenesis).目前,RhoA/ROCK-MAPK信号通路在Ang Ⅱ介导的EPC血管新生中的作用未见报道。本研究着重探讨RhoA/ROCK-MAPK信号通路在Ang Ⅱ介导的EPCs成血管相关功能中的作用,为血管新生相关疾病治疗提供重要靶点。第一部分RhoA/ROCK信号通路在血管紧张素Ⅱ诱导内皮祖细胞成血管相关功能中的作用研究目的：本研究主要探索Ang II对EPCs增殖、迁移、黏附功能和体外血管形成能力的影响,同时进一步研究该作用是否与RhoA/ROCK-MAPK信号通路有关。方法：(1) EPCs在无血清EBM-2培养基中孵育24小时后,加入不同浓度AngⅡ(0,0.1,1,10,100μM)共同作用48小时,检测细胞增殖、迁移、黏附功能和体外血管形成能力。(2)在EPCs中加入RhoA/ROCK通路抑制剂包括(?)牛儿(?)牛儿基转移酶抑制剂GGTI-286, Rho的抑制剂C3exoenzyme或ROCK的抑制剂Y-27632先孵育30min,然后与Ang Ⅱ(1μM)共同孵育48h,加药前细胞在无血清EBM-2培养基中孵育24h,检测细胞增殖、迁移、黏附功能和体外血管形成能力。(3)在EPCs中加入C3exoenzyme孵育48h,然后加入Ang Ⅱ(1μM)共同孵育15min,用pull down试剂盒和western blot技术检测活化RhoA的改变。(4)在EPCs中加入C3exoenzyme, GGTI-286和Y-27632孵育48h,然后加入Ang Ⅱ (1μM)共同孵育15min,用western blot技术检测检测ERK1/2, JNK和p38MAPK的活性。结果：(1) Ang Ⅱ促进EPCs迁移、黏附功能和体外血管形成能力,在1μM和10μM时作用显著,不影响EPCs增殖能力。(2) RhoA/ROCK通路抑制剂C3exoenzyme, GGTI-286和Y-27632可抑制Ang Ⅱ对EPCs迁移、黏附功能和体外血管形成能力的促进作用。(3) Ang Ⅱ增加RhoA的活性,该作用能被Rho的抑制剂C3exoenzyme抑制。(4) Ang Ⅱ促进JNK和p38的激活,该作用能被C3exoenzyme, GGTI-286和Y-27632抑制。结论：本研究结果表明,Ang Ⅱ促进EPCs迁移、黏附功能和体外血管形成能力,该作用主要是通过激活RhoA/ROCK及其下游MAPK通路来实现。第二部分法尼基焦磷酸合成酶抑制剂唑来膦酸钠对内皮祖细胞成血管相关功能的影响及机理研究目的：本研究探索法尼基焦磷酸合成酶抑制剂唑来膦酸钠(Zoledronate, Zol)和Ang Ⅱ对EPCs增殖、迁移、黏附和体外血管形成能力的影响,同时进一步研究该作用是否与RhoA/ROCK-MAPK信号通路有关。方法：(1)在EPCs中加入不同浓度Zol (0,25,50,75,100μM)和GGOH (50μM)共同孵育30min后再加入Ang Ⅱ(1μM)共同作用48小时,加药前细胞在无血清EBM-2培养基中孵育24小时,检测细胞增殖、迁移、黏附和体外血管形成能力。(2)在EPCs中加入Zol (50μM)和GGOH (50μM)孵育48h,然后加入Ang Ⅱ (1μM)共同孵育15min,用pull down试剂盒和western blot技术检测活化RhoA的改变及Erkl/2, JNK和p38MAPK的活性。结果：(1)Zol呈剂量依赖性抑制Ang Ⅱ对EPCs增殖、迁移、黏附和体外血管形成能力的促进作用,GGOH能够部分逆转Zol对EPCs功能的影响。(2)Zol降低Ang Ⅱ对RhoA的活化和Erk1/2、JNK的激活,该作用能被GGOH部分逆转。结论：本研究结果表明,Zol呈剂量依赖性抑制Ang II对EPCs增殖、迁移、黏附和体外血管形成能力的促进作用,从而抑制血管新生。该作用主要是通过抑制RhoA/ROCK及其下游MAPK通路来实现。