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目的:在我国糖尿病的发生率及死亡率逐年提高,而糖尿病周围神经病(Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN)是糖尿病最常见的慢性并发症。雪旺氏细胞是周围神经的主要支持细胞,在糖尿病周围神经病中自噬抑制,然而确切的机制仍未完全阐明。Rab5(Ras-related protein 5)蛋白是存在于质膜和细胞器膜中的一类调节型的小分子GTP结合蛋白,可调节细胞的自噬功能。为研究Rab5是否参与糖尿病雪旺氏细胞的自噬抑制,本研究采用糖尿病小鼠和体外培养的人雪旺氏细胞HSC(Human Schwann c ell line),探究Rab5对雪旺氏细胞自噬的影响。方法:1. Rab5蛋白在糖尿病小鼠坐骨神经中的表达将雄性CD1小鼠随机分为正常对照组(Control组)和糖尿病组(diabetic mellitus,DM组)。糖尿病模型小鼠腹腔单次注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,150 mg/kg)进行构建,喂养8周后处死小鼠,分离坐骨神经并固定于4%多聚甲醛,用于免疫组织化学染色。免疫组织化学检测坐骨神经中Rab5的表达。2.Rab5表达对体外培养雪旺氏细胞自噬的影响人雪旺氏细胞HSC在37℃,5%CO2培养箱内用含10%的胎牛血清及1%青链霉素混合液的DMEM培养基培养。(1)检测高糖对HSC细胞Rab5表达及细胞自噬的影响:将HSC细胞随机分为三组,正常糖组(normal glucose,N)、甘露醇组(D-Mannitol,M)、和高糖组(high glucose,H),以上三组分别刺激24 h、48 h、72 h后收集细胞。Western blot和免疫荧光技术检测HSC细胞中Rab5、LC3和P62蛋白的表达情况;(2)检测敲低Rab5基因对正常糖培养的HSC细胞自噬的直接影响:使用购买来的Lipofectamine 2000转染试剂将p Genesil-1-Rab5质粒和空白质粒p Genesil-1分别转染入人雪旺氏细胞HSC细胞。细胞随机分为正常对照组(normal glucose,Blank)、阴性对照组(normal glucose+p Genesil-1,Vehicle)和Rab5 sh RNA转染组(normal glucose+p Genesil-1-Rab5,Rab5sh RNA)。转染48 h后正置荧光显微镜观察转染效率;Western blot检测LC3和P62蛋白表达。3.NF-κB信号通路对高糖刺激的HSC细胞Rab5表达及细胞自噬的影响(1)检测抑制NF-κB信号通路对高糖诱导的HSC细胞自噬的影响:细胞随机分为高糖对照组(high glucose,H)、高糖+溶剂对照组(high glucose+DMSO,H+DMSO)和高糖+SN50组(high glucose+SN50,H+SN50),SN50刺激48 h后,收取细胞。Western blot和免疫荧光技术检测Rab5、LC3和P62蛋白表达。(2)检测敲低Rab5后NF-κB通路对高糖刺激的HSC细胞自噬的影响:细胞随机分为正常糖组(normal glucose,N)、高糖组(high glucose,H)、高糖+SN50组(high glucose+SN50,H+SN50)和高糖+SN50+p Genesil-1-Rab5组(high glucose+SN50+p Genesil-1-Rab5,H+SN50+Rab5 sh RNA),Western blot检测Rab5、LC3和P62蛋白表达。结果:1. Rab5蛋白在糖尿病小鼠坐骨神经组织中的表达免疫组织化学结果显示:Rab5主要在坐骨神经形成髓鞘的雪旺氏细胞胞质中表达。糖尿病小鼠与正常小鼠相比,糖尿病小鼠坐骨神经组织中的Rab5表达减少。2. Rab5表达对体外培养雪旺氏细胞自噬的影响(1)Western blot结果显示:高糖组Rab5蛋白较甘露醇组在48 h和72 h均降低,分别下降57.76%和62.43%(P<0.05)。免疫荧光结果显示:正常对照组Rab5在HSC细胞的细胞胞浆中大量表达,而高糖刺激下Rab5在HSC细胞胞浆中仅见少量表达。高糖刺激下LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值下调,同时P62的表达水平升高。Western blot结果显示:与甘露醇组相比较,高糖组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在48 h和72 h分别下降55.92%和52.85%,高糖组P62的表达是甘露醇组的2.37倍和2.86倍(P<0.05)。免疫荧光结果显示:高糖刺激下,HSC细胞中LC3荧光强度降低,P62荧光强度增加。(2)Western blot结果显示:Rab5 sh RNA转染正常培养的HSC细胞明显降低了Rab5蛋白的表达,与阴性对照组相比,Rab5 sh RNA转染组Rab5表达减少64.58%;Rab5 sh RNA转染正常培养的HSC细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值降低,与阴性对照组相比降低74.38%,同时P62表达是阴性对照组的2.98倍(P<0.05)。3. NF-κB通路对高糖刺激的HSC细胞Rab5表达及自噬的影响。(1)Western blot结果显示:SN50能显著逆转高糖诱导的Rab5表达下调,Rab5在高糖+SN50组的表达是高糖+溶剂对照组的2.13倍;阻断NF-κB信号通路细胞自噬水平升高,高糖+SN50组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值是高糖+溶剂对照组的1.65倍,而P62表达降低65.82%,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光结果显示:高糖+SN50组Rab5和LC3表达增加,而P62表达降低。(2)Western blot结果显示:与高糖+SN50组相比,高糖+SN50+p Genesil-1-Rab5组Rab5表达减少45.62%;LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值与高糖+SN50组比较降低51.63%,同时P62表达升高3.44倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.在糖尿病小鼠坐骨神经及高糖培养的HSC细胞中Rab5表达降低,且伴随着细胞自噬减少。提示Rab5可能参与糖尿病雪旺氏细胞自噬减少导致的细胞损伤。2.应用sh RNA质粒转染技术抑制正常糖培养下HSC细胞Rab5的表达,可显著减少雪旺氏细胞自噬,提示高糖刺激导致的雪旺氏细胞自噬减少可能是通过降低Rab5表达实现的。3. SN50通过抑制NF-κB信号通路活化,逆转了高糖培养的HSC细胞Rab5表达降低和细胞自噬减少;同时在高糖条件下敲低HSC细胞中Rab5基因表达可抑制SN50刺激导致的HSC细胞自噬能力增强,提示NF-κB信号通路可通过抑制Rab5的表达来参与高糖刺激的雪旺氏细胞自噬降低导致的细胞损伤。