论文部分内容阅读
目的:肝星状细胞活化是肝纤维化发生发展的关键机制,其活化过程中发生的表型改变已获得认识,但是导致这一系列表型改变的精细机制仍知之甚少。本课题组前期已证实缺氧诱导因子-1(Hif-1)通过调节自噬影响肝星状细胞的活化,通过全基因组表达芯片分析缺氧诱导的肝星状细胞内自噬相关基因的表达,筛选到与自噬相关的Bnip3(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3)蛋白。在此基础上开展本课题,旨在探讨核转录因子Hif-1靶基因Bnip3调控肝星状细胞活化和自噬的可能机制,以进一步揭示肝纤维化发生发展的相关机制,寻找逆转肝纤维化的靶点。方法:采用氯化钴(CoCl2)化学诱导缺氧法刺激人肝星状细胞系LX-2细胞,qPCR和Western blot检测LX-2细胞中Bnip3的表达;以日本血吸虫感染小鼠为肝纤维化动物模型,用免疫组织化学染色法检测小鼠肝脏组织中Bnip3的表达;对LX-2进行缺氧处理,Western blot检测P62、α-SMA以及LC3B表达,免疫荧光染色技术检测P62,观察LX-2细胞自噬;用Hif-1抑制剂YC-1抑制Hif-1的表达,缺氧或LPS刺激LX-2细胞,用Western blot和免疫荧光染色激光共聚焦显微镜检测Bnip3表达;用特异性siRNA干扰Bnip3表达,用Western blot检测LX2在缺氧或LPS刺激下α-SMA、LC3B表达;胶原酶消化-Percoll分离法分离BALB/c小鼠的原代肝星状细胞,用Western blot检测原代肝星状细胞自然活化过程中Hif-1、Bnip3和自噬相关分子LC3B和P62以及活化相关分子α-SMA的表达,用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜检测GFAP、Bnip3及P62的表达;在原代肝星状细胞体外自然活化过程中加入Hif-1抑制剂YC-1,Western blot和免疫荧光染色激光共聚焦显微镜检测Bnip3的表达,用特异性siRNA干扰Bnip3表达,Western blot检测原代肝星状细胞自然活化过程中α-SMA和LC3B表达。结果:缺氧处理的人肝星状细胞LX-2和血吸虫肝纤维化小鼠肝脏组织中Bnip3分子表达升高;LX-2缺氧处理后发生自噬;抑制LX-2细胞中Hif-1α表达可减少Bnip3的表达;干扰LX-2细胞中Bnip3表达可阻抑LX-2细胞自噬发生并抑制细胞活化;小鼠原代肝星状细胞在体外自然活化过程中Bnip3表达升高;原代肝星状细胞自然活化过程中发生自噬且Hif-1α表达升高;抑制原代肝星状细胞中Hif-1α表达,Bnip3表达不再升高;干扰原代肝星状细胞中Bnip3表达,影响肝星状细胞活化和自噬发生。结论:Hif-1通过靶分子Bnip3调控的肝星状细胞活化和自噬。