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研究背景:胶质瘤是成人最常见的原发性颅内肿瘤,是一种异质性、侵袭性肿瘤,预后不良。在遗传和分子水平上研究胶质瘤的发生和发展机制,可为胶质瘤的诊治提供新的理论依据。长链非编码RNAs（Long non-coding RNA,lnc RNAs）能从表观遗传水平、转录水平和转录后水平调控基因的表达,进而广泛参与机体的病理生理过程,与多种临床疾病密相关。多种Lnc RNAs可以通过多种信号通路调节胶质瘤细胞的生物学功能,并在胶质瘤的诊断、预后和治疗方面具有重要意义。MIAT是一种高特异性的疾病相关lnc RNA,它可以影响多种疾病的发生和相关细胞功能,如增殖、凋亡和侵袭。MIAT的调节机制也非常复杂,涉及多种信号通路或细胞因子。此外,MIAT在多种癌症组织或细胞中表达上调,例如胃癌、结直肠癌、乳腺癌和肺癌等。MIAT还能通过对多种信号通路或者mi RNA的调节,影响癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。但是,目前关于MIAT和胶质瘤关系的研究较少。本研究通过细胞实验和临床标本检测分析Lnc RNA MIAT在胶质瘤发生发展中的作用及其机制,进而为胶质瘤的诊治提供理论依据。第一章长链非编码RNA MIAT在胶质瘤中的临床意义目的:通过检测胶质瘤患者组织和血液中MIAT相对表达水平,分析MIAT在胶质瘤中的临床意义。方法:2016年1月至2017年6月本院收集胶质瘤患者200例。所有患者均是初次诊断为胶质瘤,收集时未接受任何化疗或者手术。在医院HIS病例查询系统中,查询患者的初诊时肿瘤大小、肿瘤位置、分期和Ki-67值等病理特征资料。自确诊时起,对所有研究对象定期随访,随访间隔为4周。同期,在本院体检中心收集健康对照者200例。病例和对照组研究对象收集后,在检验科收集研究对象初诊时的血样。采用自身配对的方式对每个病人采集胶质瘤组织和癌旁组织。RT-PCR检测血液和组织样本中Lnc RNA MIAT的表达水平。结果:1.MIAT相对表达水平在癌组织和癌旁组织中的四分位数分别是0.76（0.68-0.83）和0.32（0.21-0.45）,癌组织中的MIAT相对表达水平显著高于癌旁组织。2.在肿瘤大于等于5厘米、Ki-67值大于10、KPS评分小于70分的胶质瘤患者癌组织中的MIAT相对表达水平显著高于在肿瘤小于5厘米、Ki-67值小于等于10、KPS评分大于等于70分的胶质瘤患者。Ⅳ期胶质瘤患者癌组织的MIAT相对表达水平依次高于Ⅱ期和Ⅲ期。3.MIAT高表达组和MIAT低表达组胶质瘤患者的中位生存期分别是21.4和30.5个月,两组患者的生存期差异有统计学意义。4.分期Ⅳ、肿瘤大小大于5cm、Ki-67值﹥10、KPS评分﹤70、累及多个脑叶、MIAT高表达是胶质瘤预后的独立危险因素。5.复发胶质瘤患者癌组织中的MIAT相对表达水平显著高于未复发患者。6.胶质瘤患者血液中的MIAT相对表达水平显著低于健康对照,血液Lnc RNA MIAT诊断胶质瘤的曲线下面积、敏感性和特异性分别是0.891、0.875和0.804。结论:MIAT在胶质瘤组织和血液中高表达,并与胶质瘤患者的分期、肿瘤大小、Ki-67值和KPS评分相关。MIAT高表达是胶质瘤预后的独立危险因素,并与胶质瘤患者的复发相关。血液MIAT对胶质瘤患者具有较好的诊断价值。第二章长链非编码RNA MIAT对胶质瘤细胞功能的影响目的:在胶质瘤细胞中敲除MIAT基因,研究MIAT敲除对胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡能力的影响。方法:人星形胶质细胞HA1800、人胶质瘤细胞系U251、U373和SHG-44和人多形性胶质瘤细胞T98购买于中国医学科学院基础医学研究所。分组:U251和T98细胞分别分为空白组、空载组、MIAT抑制组。空白组细胞不作处理,空载组和MIAT抑制组分别转染空载质粒和MIAT抑制质粒。RT-PCR检测各组细胞中Lnc RNA MIAT的表达水平。分别使用CCK8法、Transwell实验、流式法和划痕实验检测胶质瘤细胞的增殖能力、侵袭能力、凋亡水平和迁移能力。结果:1.MIAT在U251、U373、SHG-44和T98细胞中的相对表达水平显著高于HA1800细胞,MIAT在U251、U373和SHG-44细胞中的相对表达水平显著低于T98细胞。2.胶质瘤细胞U251和多形性胶质瘤细胞T98中,各组的细胞均不断增殖,但是对照组和空载组的增殖速度较快,MIAT抑制组细胞的增殖速度较慢。在U251细胞中,空白组、空载组和MIAT抑制组中细胞增殖倍数分别是5.12±1.14、4.78±1.25和2.03±1.02。在T98细胞中,空白组、空载组和MIAT抑制组中细胞增殖倍数分别是7.25±1.59、6.51±2.08和3.15±1.14。在U251和T98细胞中,MIAT抑制组细胞的增殖倍数均显著低于空白组和空载组。3.在U251细胞中,空白组、空载组和MIAT抑制组中穿膜细胞数分别是153±21.0、176±26.2和52.1±10.5。在T98细胞中,空白组、空载组和MIAT抑制组的穿膜细胞数分别是225±18.6、253±31.2和92.3±15.6。在U251和T98细胞中,MIAT抑制组的穿膜细胞数显著低于空白组和空载组。4.在U251细胞中,空白组、空载组、MIAT抑制组细胞的愈合率分别是16.3±2.51、14.5±3.26和5.26±2.17。在T98细胞中,空白组、空载组和MIAT抑制组细胞的愈合率分别是24.7±5.16、25.1±5.47和8.73±3.15。在U251和T98细胞中,MIAT抑制组细胞的愈合率均显著低于空白组和空载组。5.在U251细胞中,空白组、空载组、MIAT抑制组细胞的凋亡率分别是25.6±5.19、26.1±5.96和39.5±8.15。在T98细胞中,空白组、空载组和MIAT抑制组细胞的凋亡率分别是15.6±3.82、12.8±4.18和31.8±5.79。在U251和T98细胞中,MIAT抑制组细胞的凋亡率显著高于空白组和空载组。结论:MIAT在胶质瘤细胞中高表达,敲除MIAT基因能显著降低U251和T98细胞的增殖、侵袭和迁移能力,并能显著促进凋亡。第三章长链非编码RNA MIAT通过mi RNA-29a调节胶质瘤化疗敏感性目的:分析MIAT和mi RNA-29a对胶质瘤治疗效果的影响。在细胞实验中,分析MIAT和mi RNA-29a对胶质瘤细胞替莫唑胺敏感性的影响,及其相互关系。方法:按照实体瘤的疗效评价标准对患者的近期治疗效果进行评价。人胶质瘤细胞U251购买于南京科佰生物科技有限公司。采用分布诱导法培养人胶质瘤耐药细胞系U251/TMZ。U251/TMZ细胞分别分为空白组、空载组、MIAT抑制组、mi RNA-29a组和MIAT+mi RNA-29a抑制组。空白组不做处理、空载组、MIAT抑制组、mi RNA-29a组分别转染空载质粒、MIAT抑制质粒和mi RNA-29促表达质粒,MIAT+mi RNA-29a抑制组转染MIAT和mi RNA-29a抑制质粒。分别采用浓度为5、10、20、50、100、200、400和800?M的TMZ溶液干预各组细胞。培养48小时后,CCK-8法检测细胞的存活率。以TMZ浓度为横坐标、细胞存活率为纵坐标,绘制剂量反应曲线,根据公式计算细胞的耐药指数(耐药指数=IC50U251/TMZ/IC50U251)。q RT-PCR实验检测组织和细胞中的mi RNA-29a表达水平。结果:1.MIAT疾病控制组（CR+PR+SD）胶质瘤患者癌组织中的相对表达水平显著低于未控制组（PD）。mi RNA-29a疾病控制组胶质瘤患者癌组织中的相对表达水平显著高于未控制组。2.MIAT在U251/TMZ细胞中的相对表达水平显著高于U251细胞（t=6.12,P=0.002）。mi RNA-29a在U251/TMZ细胞中的相对表达水平显著低于U251细胞（t=5.33,P=0.009）。3.相对于U251细胞,U251/TMZ细胞的剂量反应曲线右移,说明其耐药性增加。U251和U251/TMZ细胞的IC50分别是21.6m M和141.8Mm,U251/TMZ细胞的耐药指数是6.56。4.相对于空白组和空载组,MIAT抑制组的剂量反应曲线明显左移,说明其耐药性减弱。在TMZ浓度为100m M时,MIAT抑制组的细胞存活率显著低于空白组和空载组。5.mi RNA-29a在空白组、空载组和MIAT抑制组的相对表达水平分别是0.96?0.13、0.86?0.28和2.08?0.34。MIAT抑制组的mi RNA-29a相对表达水平显著高于空白组和空载组。6.相对于空白组和空载组,mi RNA-29a组的剂量反应曲线明显左移,说明其耐药性减弱。在TMZ浓度为100m M时,mi RNA-29a组的细胞存活率显著低于空白组和空载组。7.相对于MIAT抑制组和mi RNA-29a组,MIAT+mi RNA-29a抑制组的剂量反应曲线明显右移,说明其耐药性增强。在TMZ浓度为100m M时,MIAT+mi RNA-29a抑制组的细胞存活率显著高于MIAT抑制组和mi RNA-29a组。结论:mi RNA-29a的表达水平和胶质瘤治疗呈正相关,并在U251/TMZ细胞中低表达。mi RNA-29a能降低U251/TMZ细胞对TMZ的耐药性。MIAT的表达水平和胶质瘤治疗效果呈负相关,并在U251/TMZ细胞中高表达。抑制MIAT的表达能促进U251/TMZ细胞中mi RNA-29a表达,并降低细胞对TMZ的耐药性。第四章长链非编码RNA MIAT通过mi RNA-200a调节胶质瘤中Wnt/β-catenin信号通路目的:在胶质瘤患者的组织和胶质瘤细胞中,进一步分析MIAT和mi RNA-200a、Wnt/β-catenin信号通路的关系,及其对胶质瘤细胞的作用,进而为阐明MIAT在胶质瘤中的作用机制提供依据。方法:将U251细胞进行不同的处理,分为空白组、空载组、MIAT抑制组和MIAT抑制+mi RNA-200a组。空白组不做处理、空载组、MIAT抑制组分别转染空载质粒和MIAT抑制质粒。MIAT抑制+mi RNA-200a组转染MIAT抑制质粒和mi RNA-200a过表达质粒。免疫蛋白印迹法检测组织和细胞中的β-catenin、p-GSK-3β、APC、Axin蛋白表达水平。结果:1.mi RNA-200a在癌旁组织和胶质瘤组织中的相对表达水平分别是0.86?0.23和0.35?0.14,mi RNA-200a在胶质瘤组织中的相对表达水平显著低于癌旁组织。β-catenin在胶质瘤组织中的相对表达水平显著高于癌旁组织。p-GSK-3β、APC和Axin蛋白在胶质瘤组织中的相对表达水平显著低于癌旁组织。2.在胶质瘤患者癌组织中,MIAT水平和β-catenin相对表达水平呈显著正相关,和mi RNA-200a、p-GSK-3β、APC、Axin相对表达水平呈显著负相关。mi RNA-200a水平和β-catenin相对表达水平呈显著负相关,和p-GSK-3β、APC、Axin相对表达水平呈显著正相关。3.空白组、空载组和MIAT抑制组胶质瘤细胞中mi RNA-200a相对表达水平分别是1.09±0.26、1.24±0.21和2.31±0.34,MIAT抑制组胶质瘤细胞中mi RNA-200a相对表达水平显著高于空白组和空载组。4.MIAT抑制组的β-catenin蛋白显著低于空白组和空载组,MIAT抑制组的p-GSK-3β、APC和Axin蛋白显著高于空白组和空载组。5.mi RNA-200a组的β-catenin蛋白显著低于空白组和空载组,mi RNA-200a组的p-GSK-3β、APC和Axin蛋白显著高于空白组和空载组。6.MIAT+mi RNA-200a抑制组的β-catenin蛋白显著高于MIAT抑制组和mi RNA-200a组,MIAT+mi RNA-200a抑制组的p-GSK-3β、APC和Axin蛋白显著低于MIAT抑制组和mi RNA-200a组。7.MIAT抑制组和mi RNA-200a组的增殖倍数、穿膜细胞数、愈合率显著低于空白组和空载组,MIAT+mi RNA-200a抑制组的增殖倍数、穿膜细胞数、愈合率显著高于MIAT抑制组和mi RNA-200a组。MIAT抑制组和mi RNA-200a组的细胞凋亡率显著高于空白组和空载组,MIAT+mi RNA-200a抑制组的细胞凋亡率显著低于MIAT抑制组和mi RNA-200a组。结论:MIAT敲除能促进mi RNA-200a表达,并抑制Wnt/β-catenin信号通路、胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力,促进细胞凋亡。