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鼠伤寒沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌,随着抗菌药物在防治沙门氏病中的广泛使用,使鼠伤寒沙门菌对临床上常用药物产生了高耐药性和多重耐药性(MDR)。细菌中存在多种双组分信号转导系统(TCSs)与细菌耐药性及多重耐药(MDR)的形成密切相关。CpxAR系统是阴性菌中普遍存在的TCS之一,对沙门菌的耐药性及MDR有重要的调控作用。目前发现与鼠伤寒沙门菌黏菌素耐药相关的通路是由TCSs PhoPQ和PmrAB介导,其中MgrB为PhoPQ的负性调控蛋白。研究发现:肺炎克雷伯菌中IS5-like、IS1-like、ISKpn14的插入导致mgrB截短或失活在黏菌素耐药中起重要作用,目前还没有研究发现cpxR在acrB缺失背景下对鼠伤寒沙门菌mgrB的调控作用。本研究通过探索鼠伤寒沙门菌TCS CpxAR的应答调节子CpxR对黏菌素耐药通路中负性调控蛋白MgrB的调控作用,分析CpxR的调控通路,为进一步研究不同TCSs之间的相互作用提供新的理论思路和试验依据。运用Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌mgrB单基因缺失株(JSΔmgrB::kan简写为:JSΔ3::kan),PCR扩增出mgrB完整的开放性阅读框;并将其克隆至原核表达载体pBAD/HisA上;电转化到本实验室前期构建的JSΔacrBΔcpxR(简写为:JSΔ1Δ2)中;获得回补菌株(JSΔ1A2/pmgrB);利用Over-lapping PCR方法,构建cpxR和mgrB的联合表达菌株(JSΔ1 Δ2/pcpxR-mgrB);利用噬菌体转导技术,以前期构建的JSΔ1Δ2为受体菌,JSΔ3::kan为供体菌,在噬菌体P22的作用下构建acrB、cpxR和mgrB三基因缺失株及相应基因回补株。用微量肉汤稀释法测定了各菌株对黏菌素的最小抑菌浓度(MICs),同时测定了各菌株在LB肉汤和M9-0.2%葡萄糖中的生长曲线。结果表明:成功构建了鼠伤寒沙门菌mgrB单基因缺失株(JSA3::kan),mgrB回补菌株(JSΔiΔ2/pmgrB和cpxR-mg)rB联合表达株(JSA1Δ2/pcpxR-mgrB)、三基因缺失株及其相应基因回补株(JSΔ1 Δ2A3::kan、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pmgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR-mgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR)。MIC结果显示:JSΔ1 Δ2/pcpxR-mgrB 对黏菌素的 MIC 值较 JSΔ3::kan、JSΔ1Δ2A3::kan/pcpxR、JSΔ1Δ3::kan/pmgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpR-mgrB 分别下降 16、8、8、4倍;JSΔ3::kan对黏菌素的 MIC 值较 JS 上升2倍;JSA1Δ2Δ3::kan/pmgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR、JSΔ1Δ2Δ3::kan对黏菌素的 MIC 值未发生变化。杀菌曲线试验证明 JSΔ3::kan、JSA1Δ2/pmmgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan、JSA1Δ2Δ3::kan/pmgrB、JSΔ1Δ2Δ,::kan/pcpxR-mgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR、JSΔ1Δ2/pcpxR-mgrB菌株在30 min-12 h内用不同浓度的黏菌素孵育后,细菌活性均受到不同程度的抑制,在12.8 mg/L的黏菌素孵育8 h后,这些菌株存活率下降至10%以下。进一步对各菌株的生长情况分析表明:在LB肉汤培养基中JS、JSΔ1Δ2::kan、JSΔ3::kan、JSΔ1Δ2、JSΔ1Δ2/pmgrB、JSΔ1Δ2::kar/pcpxR、JSΔ1Δ2Δ3::kan、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pmgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR-mgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR、JSΔ2/pcpxR-mgrB 菌株在0-8 h时产生相似的生长曲线,但在14 h时显示不同的终点,JSΔ1Δ2/pcpxR-mgrB的生长活性最高(与 JS 相比,P<0.003),JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR-mgrB 的生 长活性最低(与 JSΔ1Δ2/pcpxR-mgrB相比,P<0.0001)。在M9-0.2%葡萄糖培养基中24 h时则观察到不同的现象,JSΔ1Δ2/pcpxR-mgrB的生长活性较低(与JSΔ1Δ2Δ3::kan相比,p<0.00006),JSΔ1Δ2Δ3::kan的生长活性最高(与JSΔ1Δ2::kan相比,p<0.01)。这些结果表明:cpxR通过调控黏菌素耐药通路中mgrB及下游的多个靶基因的表达,从而调控鼠伤寒沙门菌对黏菌素的敏感性。