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大豆皂醇B，一种齐墩果烷型五环三萜，可由大豆皂苷经过酸、微生物或者酶水解而得，具有比大豆皂苷更高的生物活性，被广泛用于医药行业。然而，皂苷在脱脂大豆中含量低，导致大豆皂醇B生产困难，利用合成生物学及代谢工程手段构建酿酒酵母工程菌，异源合成大豆皂醇B，为人类与疾病的斗争提供了新希望。
为使酿酒酵母能异源合成大豆皂醇B，首先引入甘草来源β-香树脂醇合酶使菌株能合成前体物β-香树脂醇。随后，调控MVA途径中的关键基因表达，研究基因单拷贝表达与多拷贝表达对产量的影响，研究不同类型启动子对产量的作用，β-香树脂醇的产量提高到17.6mg/L，是原始菌株L01(0.68 mg/L)的25.8倍。
其次，构建生产大豆皂醇B的工程酿酒酵母菌株，选择两种来源的P450酶与两种来源的CPR排列组合，进行适配性研究，甘草来源的P450酶与甘草来源的CPR适配性最佳，合成大豆皂醇B0.96mg/L。然而，对甘草来源CPR跨膜结构域进行预测，并截短跨膜区氨基酸序列，发现截短之后未能检测到产物，菌株生长量相比完整基因表达时下降了60%。
优化GgCYP与GgCPR的表达，使两个P450酶活性最大化。选择三种不同长度的Linker，进行两个P450酶分别与还原酶的融合表达和共表达实验。通过蛋白融合促进电子在氧化还原体系间的传递，提高大豆皂醇B的产量。第一个P450酶CYP93E3与CPR通过三种不同的Linker融合表达且第二个P450与GgCPR共表达之后，产生了负向效果，CYP93E3与GgCPR共表达且CYP72A566与GgCPR通过Linker3融合表达之后，大豆皂醇B的产量提高到2.9mg/L。通过优化摇瓶中的发酵条件以及在5L发酵罐中通过补加葡萄糖发酵，使得大豆皂醇B的产量达到5.81mg/L，比初始菌株L06提高了41.5倍。
本实验实现了酿酒酵母异源合成大豆皂醇B，并对合成途径涉及的两个P450酶进行了组合调控表达，显著提高了大豆皂醇B的产量，为酿酒酵母表达两个P450酶合成其他植物源天然产物提供了参考。
为使酿酒酵母能异源合成大豆皂醇B，首先引入甘草来源β-香树脂醇合酶使菌株能合成前体物β-香树脂醇。随后，调控MVA途径中的关键基因表达，研究基因单拷贝表达与多拷贝表达对产量的影响，研究不同类型启动子对产量的作用，β-香树脂醇的产量提高到17.6mg/L，是原始菌株L01(0.68 mg/L)的25.8倍。
其次，构建生产大豆皂醇B的工程酿酒酵母菌株，选择两种来源的P450酶与两种来源的CPR排列组合，进行适配性研究，甘草来源的P450酶与甘草来源的CPR适配性最佳，合成大豆皂醇B0.96mg/L。然而，对甘草来源CPR跨膜结构域进行预测，并截短跨膜区氨基酸序列，发现截短之后未能检测到产物，菌株生长量相比完整基因表达时下降了60%。
优化GgCYP与GgCPR的表达，使两个P450酶活性最大化。选择三种不同长度的Linker，进行两个P450酶分别与还原酶的融合表达和共表达实验。通过蛋白融合促进电子在氧化还原体系间的传递，提高大豆皂醇B的产量。第一个P450酶CYP93E3与CPR通过三种不同的Linker融合表达且第二个P450与GgCPR共表达之后，产生了负向效果，CYP93E3与GgCPR共表达且CYP72A566与GgCPR通过Linker3融合表达之后，大豆皂醇B的产量提高到2.9mg/L。通过优化摇瓶中的发酵条件以及在5L发酵罐中通过补加葡萄糖发酵，使得大豆皂醇B的产量达到5.81mg/L，比初始菌株L06提高了41.5倍。
本实验实现了酿酒酵母异源合成大豆皂醇B，并对合成途径涉及的两个P450酶进行了组合调控表达，显著提高了大豆皂醇B的产量，为酿酒酵母表达两个P450酶合成其他植物源天然产物提供了参考。