目的:甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤。其中,乳头状甲状腺癌,滤泡状甲状腺癌,统称分化型甲状腺癌,这包含了大部分的甲状腺恶性肿瘤,占甲状腺癌的80%。分化型甲状腺癌已经成为近十年来增长速度最快的实体肿瘤。分化型甲状腺癌中乳头状癌又占90%以上,通常表现有良好的预后,通过手术切除,放射碘治疗和甲状腺抑制治疗,10年生存期可达到97%以上。但是,仍有5-20%的患者治疗后复发,出现局部或远隔脏器转移。拥有高风险因素的这部分患者仍需更积极的诊断和治疗。槐耳是一种传统的中药,既往已有研究报道,槐耳对肝癌,乳腺癌,胃癌、肺癌,宫颈癌,结肠癌,肾癌,前列腺癌,卵巢癌,黑色素瘤等治疗有效。但是,槐耳对甲状腺癌的作用仍属空白。研究方法:1.正常培养并传代人甲状腺乳头状癌细胞株B-CPAP和人甲状腺癌未分化癌细胞株C643。配置槐耳清膏溶液并分装冻存。分别应用槐耳浓度为1mg/ml,2mg/ml,4mg/ml,8mg/ml,12mg/ml,16mg/ml的培养基培养B-CPAP和C643细胞24h,48h,72h后,CCK-8法检测在450nm的吸光度,计算药物抑制率和IC50。然后实验组细胞加入含有8mg/ml槐耳的培养基,对照组加入完全培养基,培养48h后应用流式细胞技术检测细胞凋亡(AnnexinV-FITC/PI双染法)和细胞周期变化(PI单染法)。实验组和对照组细胞计数后放入Transwell小室一定时间(C643细胞18h;B-CPAP细胞24h)后终止迁移,固定染色。同理,实验组和对照组细胞培养计数后放入含有基质胶的Transwell小室24h后,终止侵袭,固定染色。2.使用正常培养的人甲状腺乳头状癌细胞B-CPAP作为对照组,槐耳处理后的B-CPAP细胞作为实验组,进行高通量测序。提取细胞总RNA,构建转录组文库。使用Qubit Fluorometer检测文库DNA质量浓度,大于1.0 ng/μL为合格。构建好的文库用Illumina Hiseq2000/2500进行测序。使用cufflinks估算所有转录本的丰度,cuffdiff命令筛选差异基因。用箱式图、热点图等图片展示各样本中转录本或基因表达值的分布情况。用聚类分析图以及火山图等可视化展示差异基因。进行GO分析以构建基因注释。P值和q值用于测试分析的可靠性。通过GO功能显著性富集分析来确定差异表达基因的主要生物学功能。通过KEGG分析确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。使用Pearson相关性分析差异基因之间的相关性。选择两两之间相关性>0.99或<-0.99的RNA,绘制nc RNA-m RNA共表达网络图。使用Target Scan,miRWalk3.0预测可能与ncRNA靶向结合的miRNA,同时预测这些miRNA的靶基因,绘制ce RNA网络。Real-time PCR验证。3.构建GADD45A基因shRNA慢病毒载体,转染人甲状腺乳头状细胞B-CPAP,沉默GADD45A基因,建立稳转细胞株。qPCR和Western-blot检测慢病毒介导的GADD45A基因沉默效率。CCK-8法检验GADD45A基因沉默后B-CPAP细胞增殖能力的变化。应用流式细胞技术检测细胞凋亡(AnnexinV-PE/7-AAD双染法)和周期变化(PI单染法)。同时设立对照组,加药空白组和加药转染组,检测8mg/ml槐耳作用48小时后的各组细胞的凋亡率和细胞周期变化。构建GADD45A和ILF3-AS1野生型和突变型的双荧光素酶质粒。根据说明书,使用双荧光素酶检测试剂盒检测双荧光素酶活性。结果:1.槐耳抑制人甲状腺癌细胞增殖,具有剂量依赖性和时间依赖性。8mg/ml的槐耳在48小时对B-CPAP和C643增殖抑制最明显。48小时B-CPAP和C643的IC50值分别为5.604mg/ml,8.330mg/ml。甲状腺癌细胞B-CPAP,C643经8mg/ml槐耳作用48小时后,B-CPAP实验组G0/G1期的比例为72.67%±1.07,S期的比例是16.88%±1.91,G2/M期的比例是9.59%±1.16,相比对照组G0/G1期比例是63.50%±0.96,S期的比例是21.04%±0.45,G2/M期的比例是15.45%±1.35。C643实验组G0/G1期的比例为64.2%±3.34,S期的比例是28.34%±3.88,G2/M期的比例7.45%±1.08,相比对照组G0/G1期的比例是47.77%±4.23,S期的比例是39.44%±1.56,G2/M期的比例是12.79%±2.81。可见,实验组与对照组比较,G0/G1期细胞数量增加,S期和G2/M期细胞数量减少,差异有统计学意义(p<0.05)。流式细胞技术显示:8mg/ml槐耳作用细胞B-CPAP 48h后凋亡率为8.64%±1.6,相比于对照组凋亡率为4.37%±0.54,C643细胞实验组凋亡率为10.47%±1.24,相比于对照组凋亡率为5.37%±0.35。实验组和对照组有差别(p<0.05)。通过transwell实验法细胞计数观察槐耳对人甲状腺癌细胞B-CPAP和C643迁移和侵袭能力的作用。通过对迁移细胞计数,B-CPAP细胞加药组比对照组无统计学意义(305±35.36 vs 315.8±30.96,p=0.6781),但C643细胞加药组比对照组,迁移细胞数明显减少(125.6±17.36 vs 212.6±14.89,p<0.01)。同样,进一步通过由基质胶的transwell实验对侵袭细胞计数,B-CPAP加药组比对照组细胞数无统计学意义(188.8±17.08 vs 204.2±20.62,p=0.5871),而C643细胞加药组较对照组细胞数显著减少(94.8±6.98 vs 161.81±11.80,p<0.01)。2.各组样本提取的总RNA浓度和纯度以分光亮度计NanoDrop?ND-1000(Thermo Scientific,DE,USA)确认,RNA质检合格,可以进行下游实验。通过高通量测序获得了16159个已知的转录本和54772个新的转录本,确定了2185个转录本上调和5794个转录本下调。测序获得的所有24741个基因中的有5717个基因符合差异表达。与对照组相比,实验组有869个lncRNA,1个circRNA和1179个mRNA的表达上调,3781个lnc RNA,1个circRNA和921个mRNA的表达下降。数据分析DMBT1是下调最明显的转录本,其倍数变化为133.4784,ZNF780B的表达上调最明显,其倍数变化为1657.641。根据GO富集分析,270个基因富集在了上调term,171个基因富集在下调term。KEGG分析结果表明,与差异性表达基因相关的总共47个通路显著富集(p<0.05)。从共表达网络图上可以看出,这些ncRNAs可能在多条通路上参与了肿瘤的功能,包括免疫反应,细胞周期,血管生成和其他生物过程。构建ceRNA网络以显示lncRNA,miRNA和mRNA之间的调控关系。qRT-PCR验证选择的lncRNA和mRNA的表达水平,结果显示lncRNA(SNHG7,MIR181A2HG,ILF3-AS1,CTA-29F11.1)和mRNA(BBC3,CTSL,GADD45A,DDIT3)表达趋势一致(p<0.05),槐耳作用于细胞后,这些RNA的表达上调。3.建立敲减GADD45A基因的慢病毒稳转细胞系。验证转染效率。通过Real-timePCR检测转染后B-CPAP细胞的GADD45A mRNA水平的变化,与空白对照组B-CPAP-Scr组(Scr组)相比,B-CPAP-sh-GADD45A组(shRNA组)表现出较高的敲减效率(p<0.01)。Western blot方法检测GADD45A基因敲减后的蛋白表达情况,结果与Real-time PCR结果一致,shRNA组蛋白表达明显下降(p<0.05)。通过CCK-8法检测培养细胞24h、48h、72h时,在450nm的吸光度,绘制细胞增殖曲线,对比阴性对照组(Ctrl组)和Scr组,sh-RNA组细胞的增殖能力呈现时间依赖性升高。流式细胞技术结果显示,与Scr组相比,shRNA组G0/G1期细胞数减少(47.77%±4.23 vs 67.20%±4.28,p<0.01),S期细胞数增多(39.44%±1.56 vs 22.49%±3.42,p<0.01),但G2/M期细胞数变化无统计学意义(12.79%±2.81 vs 11.30%±4.07,p=0.6306)。shRNA组较Scr组细胞凋亡率(3.97%±0.34 vs 5.56%±0.18,p<0.05)和存活率(81.46%±0.86 vs 78.63%±1.08,p=0.0495)均有统计学意义(p<0.05)。8mg/ml槐耳作用细胞48小时后,结果分析,GADD45A表达下调后,shRNA加药组对比Scr加药组显著降低槐耳对细胞凋亡的诱导。加药后shRNA组的凋亡率是10.44%±1.67,Scr组的凋亡率是16.45%±0.91,两组分析具有统计学意义(p<0.01)。shRNA加药组的存活率是74.28%±3.90,Scr加药组的存活率是55.05%±11.22,两组分析具有统计学意义(p<0.05)。shRNA加药组G0/G1期的细胞数对比Scr加药组显著降低(69.11%±2.90 vs 76.34%±2.26,p<0.05),S期的细胞数增多(22.07%±3.83 vs14.91%±2.25,p=0.049),具有统计学意义。G2/M期细胞数改变不明显(8.90%±3.28vs 8.74%±3.29,p=0.9572)。构建GADD45A和ILF3-AS1野生型和突变型的双荧光素酶质粒,通过双荧光素酶报告基因实验结果可见,GADD45A Wt+miR-301a-3p(+)组对比GADD45A Wt+miR-301a-3p(+)NC组荧光素酶活性显著降低(p<0.01),而GADD45A Mut+miR-301a-3p(+)组和GADD45A Mut+miR-301a-3p(+)NC组的荧光素酶活性无统计学意义(p=0.5352)。ILF3-AS1Wt+miR-301a-3p(+)组对比ILF3-AS1 Wt+miR-301a-3p(+)NC组的荧光素酶活性显著降低(p<0.05),而ILF3-AS1 Mut+miR-301a-3p(+)组和ILF3-AS1 Mut+miR-301a-3p(+)NC组荧光素酶活性无统计学意义(p=0.3694)。结论:槐耳抑制人甲状腺癌细胞增殖,具有时间依赖性和剂量依赖性。槐耳能影响人甲状腺细胞周期,使细胞停滞在静止期,减少合成期细胞的数目。槐耳通过诱导凋亡来抑制人甲状腺癌细胞增殖。槐耳能抑制人甲状腺癌细胞C643的侵袭和迁移。通过高通量测序获得了16159个已知的转录本和54772个新的转录本。筛选出5717个差异性表达基因,包括蛋白编码RNA,长链非编码RNA以及环状RNA等。这些差异性表达基因涉及分子功能,细胞成份,生物过程等,并参与多条重要的信号传导通路。通过构建共表达网络图和ceRNA图,多个lncRNA和mRNA可能通过内源性竞争性抑制参与了槐耳对人甲状腺癌细胞的作用。qPCR验证了实验组中lncRNA(SNHG7,MIR181A2HG,ILF3-AS1,CTA-29F11.1)和mRNA(BBC3,CTSL,GADD45A,DDIT3)的表达一致上调。敲减GADD45A基因后甲状腺癌细胞增殖能力增强。GADD45A表达的降低,静止期细胞减少,细胞更多的进入合成期。GADD45A表达的降低,细胞凋亡减少。GADD45A参与了槐耳调控甲状腺癌细胞周期和凋亡的机制。槐耳通过ILF3-AS1/hsa-miR-301a-3p/GADD45A ceRNA机制实现抑制甲状腺癌细胞增殖的作用。