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拟南芥作为模式植物在生物学研究中有着十分重要的作用和极大的优势。本文以Columbia野生型拟南芥为材料,用酶解法对拟南芥叶肉进行原生质体分离,用PEG介导的转化法将外源基因转化到原生质体中进行瞬时表达。文章着重分析了影响拟南芥叶肉原生质体分离和转化的因素,最终确定了原生质体的最优分离条件,建立了以拟南芥叶肉原生质体为基础的瞬时表达体系。主要实验结果如下:1.拟南芥叶肉原生质体分离的最优酶液组成及浓度。用纤维素酶R-10、半纤维素酶、果胶酶、离析酶R-10、崩溃酶的不同酶类组合对拟南芥叶肉进行原生质体分离,结果发现,在CPW盐溶液中附加1.5%纤维素酶R-10及0.5%离析酶R-10时,分离效率最高,原生质体个数达到9.55×10~6/gFW,此时细胞碎片数量也最少。2.最佳酶解条件。分别对酶解时间、酶液PH等因素进行分析。结果发现,酶PH为6.0,28℃黑暗条件酶解4h时,原生质体产量和活力最高(产量:11.42×10~6个/gFW,活力:90.2%)。3.原生质体稳定性与活力测定。选择甘露醇做为渗透压调节剂使原生质体细胞保持完整形态,用FDA染色法检测原生质体活力。结果发现,拟南芥叶肉原生质体在0.4M甘露醇的渗透压环境中可以保持完整形态,此时破碎的细胞最少,原生质体活力最高,达到90.1%。4.瞬时表达体系的建立。选择内质网膜内嵌蛋白SIP及肌动蛋白相关蛋白ARP6进行研究。通过RT-PCR扩增得到SIP(720bp)基因及ARP6(1200bp)基因,再将它们分别构建到瞬时表达载体pA7-YFP上,用PEG法将其转化入拟南芥叶肉原生质体进行表达。分析了PEG浓度,质粒DNA含量,原生质体个数等因素对转化的影响。结果发现,转化效率在一定范围内随PEG浓度及质粒DNA含量的升高而升高,当转化体系中PEG浓度为20%,质粒DNA含量为20μg,原生质体细胞数为2.5×10~4个时转化效率最高(69.37%)。