糖化酶(Glucoamylase EC.3.2.1.3.)的全称为葡萄糖淀粉酶,分子量在50KD～112KD之间,具有外切酶活性,能将淀粉等水解成葡萄糖。糖化酶是我国产量最大、应用范围最广的酶制品,具有重大的工业价值。而黑曲霉(Aspergillusniger)是其工业上的主要生产菌株。为了获得糖化酶的高产株,本文采用诱变育种的方式对实验室筛选得到的高产株黑曲霉MS1进行紫外与硫酸二乙酯(DES)的复合诱变,经过初筛、复筛与8次传代试验后,发现了一株能稳定性遗传的黑曲霉高产株MS1-2,其酶活达到35523.2 U/mL,比出发菌株提高了57.3%。为了优化黑曲霉MS1-2的液态发酵产酶条件,扩大工业化生产,本文对发酵培养基的成分及条件通过控制单因素变量法与正交试验进行研究。结果表明:A.niger MS1-2液态发酵产酶的最佳条件为:2%可溶性淀粉、6%豆饼粉、2%玉米浆、0.2%硫酸铵、pH为5、接种量5%、装液量50mL(250mL的锥形瓶)、温度30℃、转速200r/min、发酵培养6d,所产糖化酶活力为41214.1U/mL,比出发菌株的酶活提高了 15.6%。并对A.niger MS1-2糖化酶的酶学性质进行探讨研究,发现糖化酶的最适反应温度为55℃,最适pH值为5;在70℃中保温1h,酶活力还余51.9%。本文根据NCBI上所公布的A.niger糖化酶基因序列设计引物,通过PCR从A.nigerMS1-2的染色体中扩增得到糖化酶基因片段(gla)及其非编码区5’的上游900bp片段,并分别进行测序分析。结果为:A.niger MS1-2的糖化酶基因大小为2172bp,与A.niger CBS 513.88的比较发现,gla未发生突变,但5’上游区有7个碱基发生了突变,这说明黑曲霉MS1-2糖化酶表达量的增加与其结构基因无关,可能与上游区发生7个碱基的突变有关。将gla双酶切后与质粒相连,构建重组质粒pPIC9K-gla;通过电穿孔技术将其整合至毕赤酵母GS115中,筛选重组子。重组毕赤酵母用1%的甲醇诱导72h时,糖化酶活力达到最高为23.8U/mL。重组表达酶的最适反应温度和pH分别为50℃和5。