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研究背景:指数富集的配体系统进化(SELEX)技术系指在体外从人工合成的ssDNA或RNA 随机序列库中寻找与靶分子特异结合片段的过程,其实质是试管中的人工进化。筛选出的分子称为核酸适体(aptamer)。随机库中核酸分子空间构象的多样性是核酸分子与其它分子相互作用的基础。核酸适体代表着一类功能与抗体相似的新型分子,它的靶分子广、分辨率高、化学修饰便利、组织穿透能力强等特点,令其在基础研究、临床诊断、药物研制方面得以广泛应用。目前,VEGF、癌细胞表面特定蛋白Nucleolin及凝血酶的核酸适体已进入临床试验阶段。TGF-βs在纤维化病变的发生发展中起重要作用,其受体主要分三型:TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和TGF-βRⅢ。TGF-βRⅢ主要负责将间质中的TGF-βs传递给TGF-βRⅡ并增强它们之间的亲和性。TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ均属跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶受体家族,其中TGF-βRⅡ能自由地与TGF-βs结合,而TGF-βRⅠ仅能识别配体与TGF-βRⅡ形成的复合物并被激活。激活的TGF-βRⅠ可进一步磷酸化下游的信号分子如Smad,引起Smad向核内转位,从而介导TGF-βs的一系列生物学效应。因此,以TGF-βRⅡ蛋白为靶点筛选和研制其拮抗剂,封阻TGF-βs的生物学活性,对于纤维化病变的防治具有积极意义。迄今为止,还未见TGF-βRⅡ核酸适体的研究报道。本研究初步探讨了利用SELEX技术从ssDNA随机库中富集TGF-βRⅡ亲和核酸库的方法,为后续分离TGF-βRⅡ单一核酸适体,获取TGF-βRⅡ新型拮抗剂奠定了基础。材料与方法:1. 初始ssDNA随机库的构建设计中间含60个随机碱基、两端为固定序列、总长108nt的ssDNA模板,交由公司合成。产品已做去保护及纯化处理。2. SELEX筛选 1) 首轮筛选:直接取适量合成的ssDNA做为初始筛选库(ssDNA-0),初始库容量<WP=10>为1.2×1015。靶蛋白TGF-βRⅡ与ssDNA-0温育后,反应混合液上样到硝酸纤维素膜上,真空抽滤,洗脱游离核酸。7M尿素、酚/氯仿回收膜上滞留的ssDNA。行PCR扩增时,采用5(端生物素化的下游引物,使PCR产物偶联上生物素。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物。利用Streptavidin-Agarose捕获dsDNA,0.15N的 NaOH使双链变性,释放非生物素标记的ssDNA,回收后用于第2轮筛选。2) 第2～4轮筛选:将靶蛋白TGF-βRⅡ预先吸附到固相基质Phenyl-Agarose上,然后与ssDNA富集库温育,洗脱未结合核酸,回收与TGF-βRⅡ结合的ssDNA。扩增、富集、分离目的ssDNA步骤同前。从第3轮筛选始,引入针对固相基质Phenyl-Agarose的反向筛选。3) 第5～8轮筛选:与第3～4轮筛选相比,做两点调整:(1)反向筛选调整为:富集库与预先吸附了BSA的固相基质Phenyl-Agarose温育。(2)筛选时,向筛选缓冲体系中加入酵母tRNA。随着筛选的进行,严谨度不断增加。3. 监测富集库进化状态1) 膜结合测定实验: 将 32P放射性标记的初始库、富集库分别与TGF-βRⅡ及BSA温育,反应混合液上样到硝酸纤维素膜上,负压抽滤,空气中干燥滤膜。液闪仪计数CPM值。以百分值〔(核酸蛋白组膜上放射残留量-单纯核酸组膜上放射残留量)/投入反应核酸的放射总量〕×100%估算核酸库对靶蛋白的亲和程度。 2) 凝胶迁移阻滞实验:将32P放射性标记的初始库、富集库分别与TGF-βRⅡ及BSA温育,反应混合液上样到4%非变性聚丙烯酰胺凝胶中,电泳,放射自显影。结果:第8轮富集库对靶蛋白TGF-βRⅡ的亲和力较初始随机库提高了22.61倍,有非常显著的差异(P<0.01)。在第8轮富集库+TGF-βRⅡ组泳道中观察到核酸-蛋白复合物滞后带。同时,虽然第8轮富集库对BSA的亲和力较原始库亦提高了11.33倍,但在凝胶迁移阻滞实验中观察不到BSA/ssDNA复合物滞后带,说明富集库ssDNA-8与BSA的结合系非特异性的。结论:经过8轮循环筛选,终极富集库对靶蛋白TGF-(RⅡ的亲和力获得了一定程度的提高,确实向着特异亲和靶蛋白TGF-(RⅡ的方向进化。本研究工作为后续分离TGF-(RⅡ单一核酸适体、获取TGF-(RⅡ新型拮抗剂奠定了基础。