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水稻斑点叶突变体是研究稻瘟病抗性、白叶枯病抗性、植物程序性细胞死亡机理的重要材料。水稻中已阐明了53份斑点叶突变体的遗传模式,多数突变体性状受单隐性基因控制,也有少数受单显性基因或双隐性基因控制。目前,已成功克隆分离了8个水稻斑点叶基因。此外,斑点叶突变体在拟南芥、大麦、玉米等作物中也广泛存在,且部分基因已克隆并进行了功能分析,这些研究促进了人们对植物过敏性反应、程序性细胞死亡现象的理解。
我们在EMS诱变的IR64突变体库中发现了一个新的斑点叶突变体材料hm47,在播种后十天的三叶期,叶片开始出现褐色斑点,并逐步扩散增多至遍布整个叶片,且伴随整个生育期,属于扩散型突变体。为了探究该突变体的生理特点、对主要病害的抗性特征、防卫反应基因表达以及遗传模式,对突变体进行了农艺性状考察、光照处理、不同时期色素含量测定、组织化学鉴定、白叶枯病和稻瘟病抗性鉴定、遗传分析和基因定位。
农艺性状考察发现,与野生型亲本IR64相比,突变体hm47植株矮小,节问缩短,株高明显降低,生育期较野生型推迟7天,有效穗数减少,穗长缩短,结实率显著降低,每穗实粒数、千粒重均减少。大田条件下,用锡箔纸对突变体hm47及野生型的新叶、老叶、叶尖、叶中部、叶基部进行遮光试验,结果表明,突变体斑点的发生受自然光诱导；苔盼蓝和DAB(diamino benzidine)染色结果显示,突变体斑点处的细胞被苔盼蓝染成深蓝色,细胞处于死亡状态,斑点部位有褐色过氧化氢沉积物生成。白叶枯病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变体对白叶枯病小种PXO86、PXO349和PXO99的抗性增强,且对PXO86、PXO349的抗性极显著增强,对PXO99的抗性显著增强,对照IR24对三个小种均表现感病,突变体对PXO61、ZH-173、PXO79、PXO112、PXO145、PXO347和JS97-2小种的抗性与野生型相比没有显著差异；用稻瘟病小种接种突变体hm47、感病对照丽江新团黑谷(LTH)和野生型亲本IR64,鉴定结果显示,与野生型相比,突变体对稻瘟病小种2007-014、js001-20-1-1和05-20-1均表现出抗性增强,而LTH表现感病。因此,初步确定该突变体是一个抗性增强的突变体。
突变体hm47与Morobereken杂交并构建F2群体进行遗传分析,经x2检验发现,该突变体的斑点叶性状受一对单隐性基因控制;采用DNA分池法(DNA pooling),选用hm47/Morobereken的F2群体中981个斑点叶单株进行基因定位,最终将该基因定位于第4染色体长臂下端,与SSR标记RM348和RM7410紧密连锁,由于水稻第4染色体该区段尚未有斑点叶基因的报道,因此推测该基因可能是一个新基因。暂命名为spl32(t)。通过进一步扩大F2群体并开发新的SSR、InDel和STS标记,最终将该基因定位于标记InDel-84和InDel-91之间,物理距离约20 kb,位于一个BAC克隆AL662953,包含4个基因,它们均编码表达蛋白,但功能未知。本研究所获得的结果和群体,为克隆分离该斑点叶基因并进一步功能验证以及探讨斑点发生机制莫定了基础。也为探寻过敏性反应和植物程序性细胞死亡机理等提供有力依据,对于揭示水稻抗病反应机制,增加水稻的广谱抗性具有重要意义。