研究背景肝脏是人体重要的代谢、内分泌和免疫器官。多种有害因素均可导致肝损伤,对肝损伤的防治目前仍是一个全球性的严峻课题。而内毒素是介导多种肝脏损伤的重要因素,肝脏疾病时可产生内毒素血症,它和肝损伤互为因果并对肝病的发生发展起重要作用。病毒性肝炎、酒精性肝病、药物与化学性肝炎等均伴有程度不等的内毒素血症。因此,研究内毒素致肝损伤的发生机制,寻找有效防治手段,筛选保肝药物,探索保肝作用原理,具有十分重要的现实意义。肝有门静脉和肝动脉双重血供,但两者最终都是通过终末微静脉和微动脉与肝血窦相连,因此肝窦是完成肝脏物质交换的主要场所。急慢性肝病时肝窦可表现不同程度的肝窦腔狭窄、淤血、循环淤滞,微血栓形成,造成邻近肝细胞溶解性坏死。重度患者肝窦腔部位被胶原纤维填充,表现为肝窦的毛细血管化,肝脏物质代谢受阻,进一步加重肝脏损伤。肝窦内皮细胞(LSEC)是构成肝窦壁的主要组成部分,可控制肝窦微循环,调节物质代谢并参与维持肝脏内环境的稳定,对肝脏物质代谢起重要的“调节器”作用。其有不同于其他内皮细胞的筛状窗孔结构和不连续的基膜。许多窗孔聚集可形成内皮筛板,在血液和肝细胞的物质交换中发挥筛选屏障作用,调节物质进出血窦的速度。病理和衰老情况下,窗孔直径和数量减少,可出现代谢异常,胶原纤维沉积,连续基底膜的形成,发生肝窦毛细血管化。严重病变时,内皮细胞缺如脱落使血小板、凝血因子等直接与细胞下基质相接触,诱发微血栓形成,加重微循环障碍,导致肝纤维化甚至肝硬化的发生和发展。故有研究者认为LSEC损伤可能是导致肝脏微循环障碍、肝细胞变性坏死的触发点。LSEC的通透性作用能够调节肝脏的物质代谢和肝窦血流,与肝主疏泄调节血流量和促进脾胃运化功能以及中药多环节,多靶点的作用特点相类似,所以LSEC可能就是中药护肝的作用靶点之一,并且与肝主疏泄相关。丹参为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根茎,性味苦,微寒,归心、肝经。具有活血祛瘀、通经止痛、清热安神的功效。其“善治血分,去滞生新,调经顺脉”之功效尤佳。故有“一味丹参,功同四物”之誉。它可作用于肝损伤的多个环节,但其具体的作用靶点和机制尚未阐明。目前,丹参中作为主要成分的多糖研究较少,本课题组对丹参多糖在抗肝损伤的机理方面进行了初步的研究,结果表明丹参多糖具有明显的抗免疫性肝损伤的作用。因此,深入阐述其作用机理,明确其作用靶点,对中医藏象及中药作用机制研究具有重大意义。目的通过研究丹参多糖对急性肝损伤小鼠LSEC形态和功能及对细胞间粘附因子(ICAM-1)、丙二醛(MDA)等指标的影响,探讨丹参多糖的护肝作用机制及可能的作用靶点。并试阐述LSEC与肝主疏泄的相关性,为中药护肝机制及肝主疏泄的物质基础研究提供科学依据。研究方法1.丹参多糖的制备丹参经南方医科大学中药鉴定教研室鉴定为纯正药材,丹参多糖的制备按照专利(一种从丹参中提取多糖的方法,公开号：200810026249.4)方法。2.动物模型的建立分组及处理将实验小鼠按体重随机分为正常对照组、模型组、丹参多糖高(15.6g·kg-1),中(7.8g·kg-1),低(3.9g·kg-1)剂量组,联苯双酯组(0.2g·k-1),每组10只。连续灌胃给药7d,正常对照组和模型组给予同等剂量生理盐水。7d后开始造模,模型组和丹参多糖组采用小鼠尾静脉注射脂多糖(LPS)(5mg·kg-1)诱导急性肝损伤模型,正常组小鼠尾静脉注射同等量生理盐水。造模3h后,动物麻醉后经门静脉灌注固定肝脏,取相同部位肝组织分别放于1.5%的戊二醛固定液和10%甲醛固定液以制备电镜样本和病理切片,剩余组织超低温冰箱冻存以备肝组织匀浆。血液3000r/min×10min离心,取血清超低温冰箱冻存以备下一步检测所需。3.LSEC电镜样本的制备与观察：将固定液中的肝组织用0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液(PH7.4)反复漂洗后梯度酒精脱水,进一步浸透、包埋切片和临界点干燥的制作由电镜室完成。每个标本先用低倍镜找到汇管区,定位于汇管区周围,至少观察5个斜断面肝窦的筛板状结构,仔细观察肝窦窗孔的数量及大小,然后在中央静脉区找至少5个视野,观察5个斜断面肝窦的筛板状结构。采用ImageJ图像软件分析系统计数肝窦内窗孔的数量及大小。4.利用免疫组化法观察丹参多糖对ICAM-1及整合素β1表达的影响常规石蜡切片脱腊,磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3min×3,3%H2O2处理消除内源性过氧化物酶,PBS漂洗3min×3,抗原修复5min,自然降至室温,PBS漂洗3min×3。加入ICAM-1一抗,37℃过夜,PBS漂洗3min×3,加入二抗—酶标多聚物37℃放置20min,PBS漂洗3min×3,DAB(新鲜配置)室温显色15min,苏木素复染细胞核,常规封片,镜下观察。另设阴性对照片染色,PBS取代ICAM-1一抗,其余操作均相同。整合素β1 (Integrin-β1)的表达操作相同。5.利用比色法观察丹参多糖对血清谷丙转氨酶(ALT)及肝组织中MDA、谷胱甘肽(GSH)的影响血清ALT含量按试剂盒说明检测。制备肝组织匀浆,按MDA、GSH测定试剂盒说明书所述步骤进行。以下列公式计算肝组织中MDA、GSH含量：肝组织中MDA含量=(测定管吸光度-空白管吸光度)／(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准品浓度÷组织匀浆蛋白含量。肝组织中GSH含量=(测定管吸光度-空白管吸光度)／(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准品浓度×GSH分子量×稀释倍数÷组织匀浆蛋白含量。6.统计方法计量资料用均数±标准差(X±S)表示,组间比较用one-way ANOVA。方差齐性时,采用LSD方法进行组间比较,如多组与对照组比较使用Dunnett检验,当方差不齐时,采用Welch稳健估计,再采用Dunnett T3方法进行组间多重比较,等级资料采用x2检验。用统计软件SPSS13.0进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.一般状态观察一般状态观察发现丹参多糖灌胃组小鼠较其他组小鼠被毛光泽、活动反应灵敏。造模后,丹参多糖组及联苯双酯组精神状态优于模型组。丹参多糖组与联苯双酯组比较无明显差异。2.电镜下小鼠肝窦超微结构的改变电镜下观察可见正常组肝细胞表面清晰毛细胆管结构,LSEC表面有大量窗孔,肝细胞大量微绒毛,并可透过窗孔到达肝窦腔。模型组肝细胞破裂,肝索结构被破坏,肝细胞微绒毛减少消失,LSEC出现失窗孔化,狄氏腔内有大量细胞外基质物质沉积,部分LSEC断裂缺如,肝窦内枯否细胞增生,红细胞等粘附,并出现血栓样结构物质。丹参多糖中、高剂量组肝细胞破裂坏死减少,LSEC窗孔数量、费雷特径及面积较模型组明显增多,肝细胞表面可见结构完整的毛细胆管,肝细胞微绒毛增多,肝窦内细胞及胶原粘附明显减少。丹参多糖低剂量组与模型组相比变化不显著。联苯双酯组与模型组相比有显著差异,与丹参多糖组相比无显著差异。3.HE染色病理观察病理结果显示,与正常组相比较,模型组肝脏病理变化显著P<0.01)。丹参多糖高,中剂量组,与模型组相比肝脏病理变化明显改善(P<0.01)。低剂量组与模型组相比肝脏病理变化差异不显著(P>0.05)。联苯双酯组与模型组及丹参多糖低剂量组相比有显著差异(P<0.01),与丹参多糖高、中剂量组相比无统计学意义(P>0.05)。4.丹参多糖对急性肝损伤小鼠ICAM-1及整合素β1表达的影响正常对照组ICAM-1、Integrin-β1几乎不表达或呈弱表达,而在模型组小鼠的表达显著高于正常组。与模型组比较,丹参多糖高、中剂量组的ICAM-1、Integrin-β1表达均显著减少,丹参多糖低剂量组变化不明显；联苯双酯组表达显著减少。丹参多糖中、高剂量组与联苯双酯组相比无明显差异,联苯双酯组比丹参多糖低剂量组表达减少。5.丹参多糖对急性肝损伤小鼠血清转氨酶的影响与正常组相比较,模型组血清ALT水平显著升高(P<0.01),表明尾静脉注射LPS后对小鼠肝组织造成了严重的损伤,动物模型建立成功。丹参多糖高,中剂量组与模型组相比有明显下降(P<0.05),丹参多糖低剂量组作用不明显(P>0.05)。联苯双酯组与模型组相比有明显差异(P<0.05),与丹参多糖组相比无统计学意义(P>0.05)。6.丹参多糖对急性肝损伤小鼠肝组织MDA及GSH的影响与正常组相比较,模型组肝组织MDA水平显著升高,而GSH含量与正常组相比显著降低(P<0.01),丹参多糖高,中剂量组与模型组相比MDA含量有显著下降(P<0.05),尤其以丹参多糖高剂量组疗效更为明显(P<0.01)。丹参多糖低剂量组作用不明显P>0.05)。而丹参多糖高,中,低剂量组肝组织GSH含量增多显著(P<0.01),表明丹参多糖具有降低急性肝损伤的肝组织中过氧化脂质含量,提高机体抗氧化能力,减少肝细胞损伤的作用。联苯双酯组与模型组及丹参多糖低剂量组相比MDA含量有显著差异P<0.05),与丹参多糖中、高剂量组相比无统计学意义(P>0.05),而丹参多糖高、中、低剂量组肝组织GSH含量与联苯双酯组相比均有统计学意义(P<0.05)。结论丹参多糖可降低急性肝损伤小鼠LSEC的损伤,并能减少胶原沉积,抑制窗孔减少所致的毛细血管化情况,从而改善肝窦内循环,减轻脂质过氧化损伤。对小鼠急性肝损伤有显著的保护作用。而LSEC可能就是其作用靶点之一,且与肝主疏泄有一定相关性。