目的皮肤是人体中最大的器官,覆盖整个机体体表,重量约占身体总质量的16%。皮肤由表皮、真皮、皮下组织与附件构成,主要作用有保护机体抵抗外界有害物质入侵、体温调节等。作为与周围环境密切接触的器官,皮肤在日常中容易遭受到烧(烫)伤。大面积深度烧伤皮肤丧失其原有组织结构与功能,皮肤中具备修复潜能的干细胞与组织遭受到严重破坏,使其自身潜在的自我修复能力也随之减弱或丧失。目前对于大面积深度烧伤创面的处理仍存在不少困扰,如可供移植自体皮肤来源不足、异种或异体皮存在免疫排斥反应与传染疾病的风险、不能永久替代、价格昂贵与创面愈合后瘢痕挛缩影响外观与功能等。临床证实烧伤后采用磨痂、削痂术等方法去除烧伤坏死层与保留烧伤变性真皮有利于促进烧伤创面愈合,而且创面愈合后质量更接近正常皮肤,其中的愈合机制错综复杂目前仍未完全阐述清楚。在深Ⅱ°或混合度烧伤中,部分真皮层并未完全坏死,只是其中细胞发生部分或一过性功能障碍,以及形态结构发生变化,但当在局部微环境得到改善后,上述现象会好转或消失,受损真皮可以逆转恢复回正常的形态和功能,说明烧伤后的变性真皮层在一定条件下具有恢复为正常真皮结构形态和功能的潜能。为减少感染来源,目前临床中早期削切痂往往会将变性真皮与完全坏死组织一并给予削除,如此不仅会造成可能逆转的变性真皮浪费,而且创面愈合后也常常导致瘢痕增生明显,造成烧伤患者外观与功能障碍。前期研究证实经离体脱细胞等技术处理后的烧伤变性真皮基质生物性能尚可、初步移植效果满意,认为可能是一种潜在的烧伤真皮替代材料。随着研究深入发现仍有许多未知之处需要进一步研究弄清。真皮取材时机的影响、如何更好地处理烧伤变性真皮基质以优化其生物性能、提高移植效果与弄清经处理后的不同时期取材制备的变性真皮基质中细胞因子等仍有待研究。基于前期烧伤变性真皮基质研究为基础,本实验拟将早期削切痂废弃的烧伤变性真皮回收,应用0.25%胰蛋白酶、0.5%Triton-100联合脱细胞处理,再给予激光微孔技术处理,制备成激光微孔脱细胞烧伤变性真皮基质(Laser micropore denatured acellular dermal matrix,LPDADM),对 LPDADM 进行生物性能检测、在体埋植、联合自体刃厚皮移植研究,并应用蛋白芯片技术对LPDADM蛋白因子进行检测,从而对其生物性能与移植效果、取材时机与移植后修复机制进行评估、探讨。本研究是系列烧伤变性真皮基质研究的完善与深化,研究结果将为下一步变性真皮基质基础研究、临床应用与组织工程化提供理论基础。方法1.LPDADM的制备与性能检测SPF级昆明雄性小鼠采用恒温水浴烫伤法进行深Ⅱ°烧伤动物建模。于致伤后设定时间点处死实验小鼠,取下烧伤部位皮肤,修剪去除完全坏死表皮与组织,切取部分组织行组织病理学检查,保留符合深Ⅱ°烧伤样本。经0.25%胰蛋白酶、0.5%Triton X-100联合处理15min后,用PBS滴定直至液体完全清亮。随机将上述处理的真皮基质分为两组,其中任一组[标记为实验组,另一组为对照组(DADM,Denatured acellular dermal matrix,变性脱细胞真皮基质)],实验组采用特定紫外激光模板打孔技术,在脱细胞变性真皮基质上打孔,孔间隙设计为1.0mm,孔径大小为135 μ m,制备成LPDADM。对比观察DADM与LPDADM的颜色、质地、弹韧性与延展性等性状。切取组织行HE染色与光学显微镜下观察细胞形态和纤维排列等,并进行相应生物性能检测。2.应用蛋白芯片技术检测不同时间点取材制备的LPDADM蛋白因子表达差异于实验动物烧伤后未感染24小时、48小时、72小时与确诊烧伤创面感染时取材。制备成LPDADM后分别进行蛋白因子检测,研究其中不同时期取材制备成的LPDADM中蛋白因子表达差异。3.LPDADM在体皮下埋植实验研究采用皮下埋植方法观察两组处理后的真皮基质在体内的组织相容性和免疫排斥反应等。在小鼠背部两侧分别取2个皮下囊,一侧囊内植入实验组LPDADM,另一侧囊内植入对照组DADM,互相不接触。观察指标:(1)埋植后第1、2、3、4周观察两组真皮基质外观、质地、弹性、纤维包裹以及表面毛细血管生长情况;(2)埋植后第1、2、3、4周光镜下对比观察两组变性真皮基质的细胞浸润、胶原排列与毛细血管植入等情况。4.LPDADM联合自体刃厚皮移植效果研究本部分研究由动物实验与临床试验两部分组成。动物实验部分:将小鼠分为两组,麻醉后在其背部裁剪出一块1 ×2cm2大小皮片,将同种异体LPDADM、DADM分别移植于两组动物皮肤缺损区域,然后将裁剪出的皮片刮除大部分真皮层修薄后覆盖缝合于真皮替代材料上并打包加压加扎,分别在术后10天、14天与21天给予观察创面大体情况、组织学检查、电镜下观察细胞形态与对比观察创面愈合率。试验部分:将入选的我科住院治疗的深度烧伤需移植自体皮修复的成年患者,随机分别应用LPDADM联合自体刃厚皮移植、HADM联合自体刃厚皮移植、单纯自体刃厚皮移植修复烧伤深度创面。术后定期观察创面大体情况、组织学检查、对比创面愈合率与主要实验室检验结果等,研究LPDADM应用效果与安全性。结果1.大体标本与镜下观察肉眼见新鲜制备的DADM呈瓷白色,质地柔软,具有一定弹性、韧性,再经激光微孔处理后制备成的LPDADM呈现整齐密集的小孔,孔周未见炭化,瓷白色,质地柔软,具有一定弹韧性。光学显微镜下显示DADM中未见上皮结构和细胞残存,真皮胶原玻璃样变性;LPDADM中未见上皮结构和细胞残存,真皮胶原见玻璃样变性,局部见轻微胶原纤维断裂现象。2.生物力学性能伤后24h时所取材制备的LPDADM的弹性模量(MPa)、最大负载力(N)与拉伸长度(cm)分别为 71.60±2.30、118.00±3.54、2.48±0.23;48h 组三指标结果分别为:70.20±2.85、107.30±6.15、2.52±0.18;72h组三指标结果分别为:71.80±2.40、123.55±4.75、2.33±0.31;创面感染时所取材制备的 LPDADM 的弹性模量(MPa)、最大负载力(N)与拉伸长度(cm)分别为:67.40±3.53、101.00±3.22、2.10±0.27,上述4组三指标各自比较,差异均无统计学意义(P>0.05),但均较未激光微孔化处理的DADM[弹性模量(MPa)35.80±2.17、最大负载力(N)67.40±3.51、拉伸长度(cm)2.66±0.05]变化明显,各自比较差异均有统计学意义(P<0.05)。3.不同时间点取材制备的LPDADM蛋白因子表达差异3.1 LPDADM蛋白成分分析显示,不同的时间点(24h、48h、72h与创面确定感染时)所取材制备的LPDADM的蛋白因子表达有差异;随着时间后移,取材所制备的LPDADM中大部分蛋白因子表达呈显逐步上升趋势,如IL-15、CCL-8、GM-CSF与MMP-3因子等;3.2与24、48与72小时未感染组比较,在感染创面中取材制备的LPDADM除MMP-24/MT5-of MMP、VE-cadherin、TCK-1、IL6 与 VEGF 表达降低外,其余蛋白因子均表达增强。4.LPDADM在体研究结果在动物体内埋植示肉眼见两组变性真皮基质埋植后均未见收缩、卷曲,亦无明显渗出、红肿等现象发生。LPDADM组2周时可见埋植变性真皮基质表面上一层分布着微细血管网的纤维薄膜。组织学检查结果显示,LPDADM组在细胞浸润、毛细血管植入等方面有差异,实验组血管植入和纤维融合程度更明显,二组仍均未见炎症细胞浸润现象。LPDADM联合自体刃厚皮动物研究结果显示,术后第10天LPDADM组皮片呈肉红色,皮片基本成活,对照组局部呈散在黑色干性状,局部颜色偏深。术后14天创面愈合率比较,差别有统计学意义(P<0.05)。DADM组瘢痕增生较明显。HE染色显示LPDADM血管化更明显,炎症反应轻微,DADM组炎症细胞多,血管化程度较低;电镜结果显示DADM组新生组织难以长入,迁入的成纤维细胞极少,以炎症细胞为主,LPDADM组中有及少量的炎症细胞的迁入,而且迁入的成纤维细胞电镜下呈现核大呈不规则形态,粗面内质网布满细胞液中。LPDADM联合自体刃厚皮临床试验研究结果显示,与HADM组比较,相同时间下LPDADM组愈合创面稍大;LPDADM组中柔软性(1.18±0.34)分、厚度(1.24±0.47)分与创面愈合时间(28.05±5.23)天均与其相应指标统计结果差别较大,差别有统计学意义(P<0.05)。2组同种脱细胞真皮替代材料移植后血常规、生化指标、细胞免疫与细胞因子无明显差别(P>0.05)。结论1.经激光微孔技术处理后的烧伤变性脱细胞真皮基质弹性模量、最大负载力增加,拉伸长度缩短,具有较好的生物性能;2.蛋白成分分析显示,不同时间点取材制备的激光微孔烧伤变性脱细胞真皮基质中蛋白因子表达有差异。早期、创面未感染时所取材制备的激光微孔烧伤变性脱细胞真皮基质比创面感染时所取材制备的激光微孔烧伤变性脱细胞真皮基质中有利于创面愈合的蛋白因子表达高,可能更适宜于移植应用;3.经激光微孔技术处理后的烧伤变性脱细胞真皮基质皮下埋植后发现其生物相容性良好、免疫排斥反应低,比单纯烧伤变性脱细胞真皮基质更有利于细胞浸润、炎症消退、毛细血管植入;4.LPDADM联合自体刃厚皮移植能有效促进创面愈合,提高创面愈合质量且生物安全性可。