研究背景缺血再灌注损伤是肝脏外科中不可避免的病理过程。肝脏手术中，血流阻断会导致肝脏热缺血再灌注损伤，而在肝移植供肝冷灌注、保存及血流再开放过程中，又势必会产生肝脏冷缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤又诱导凋亡机制的启动，引起细胞凋亡。肝脏缺血再灌注损伤和细胞凋亡是肝脏手术后肝功能低下及移植物无功能等并发症的重要原因。研究已证实缺血预处理(ischemic precondi-tioning，IPC)，即在缺血前给予短暂“缺血一再灌注”的干预，可有效减轻肝脏缺血再灌注损伤和细胞凋亡，但在肝脏破裂出血及脑死亡供肝切取等情况下，IPC的应用受到限制。缺血后处理(ischemic postconditioning，IPO)，即长时间缺血后，在再灌注的起始阶段，立刻给予短暂重复的“灌注-再缺血”处理，是近年来提出的一种新的缺血再灌注损伤干预方式，研究已证实了IPO能提高心肌对较长时间缺血的耐受性。在本研究中，我们将探讨IPO对肝脏缺血再灌注损伤和细胞凋亡的保护作用；并进一步对比研究IPO与IPC的保护作用，分析IPC与IPO联合应用(IPC-IPO)是否能更为有效的减轻肝脏冷／热缺血再灌注损伤和细胞凋亡。第一部分缺血后处理对肝脏冷／热缺血再灌注损伤和细胞凋亡的保护作用及其机制研究目的探讨缺血后处理对肝脏缺血再灌注损伤和细胞凋亡保护作用及其机制。研究方法参照Nauta等所描述的方法建立大鼠部分肝脏30分钟热缺血模型，并根据Kamada等所描述的方法进行大鼠肝移植手术来建立肝脏2小时冷缺血模型。动物分组：1．Sham组：入腹后仅分离肝十二指肠韧带，但不阻断肝门血供；2．热缺血再灌注损伤实验2．1 IRI组：单纯30分钟热缺血后灌注，无其他干预；2．2 IPO组：在30分钟热缺血后，长时间灌注前给予3个循环的“30秒灌注-30秒再缺血”缺血后处理；3．冷缺血再灌注损伤实验3．1 IRI组：供肝2小时冷缺血后开放血流灌注，无其他干预：3．2 IPO组：在供肝2小时冷缺血后，受体结束无肝期开始长时间灌注起始阶段，给予3个循环的“30秒灌注-30秒再缺血”缺血后处理：各组在再灌注后3小时后，采集样本检测血清AST、ALT水平，胆汁葡萄糖含量、GGT水平，肝脏组织学及超微结构改变，并采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子Q(TNF-α)，白介素-1β(IL-1β)含量；采用化学比色法测定肝组织中丙二醛(MDA)含量，黄嘌呤氧化酶法测定肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用免疫组化检测检测肝细胞Fas基因的表达，流式细胞技术检测细胞凋亡。对同一模型中各组的结果进行对比性分析。研究结果1．在热缺血和冷缺血模型中，IPO组和IRI组的ALT和AST水平明显高于Sham组(P＜0.01)，并且IPO组的转氨酶水平低于IRI组(P＜0.05)。2．在热缺血和冷缺血模型中，IPO组和IRI组的胆汁葡萄糖和6GT水平都高于Sham组(P＜0.05)；并且IPO组的胆汁葡萄糖和GGT水平低于IRI组(P＜0.05)。3．在热缺血和冷缺血模型中，IPO组和IRI组肝脏组织学，超微结构改变及中性粒细胞浸润浸润程度都重于Sham组；但IPO组要轻于IRI组。4．在热缺血和冷缺血模型中，IPO组和IRI组的TNF-α和IL-1β水平明显高于Sham组(P＜0.01)，并且IPO组的TNF-α和IL-1β水平低于IRI组(P＜0.05)。5．在热缺血和冷缺血模型中，IPO组和IRI组的SOD水平都明显低于Sham组(P＜0.05)；并且IPO组的SOD水平高于IRI组(P＜0.05)。而IPO组和IRI组的MDA水平都明显高于Sham组(P＜0.05)；并且IPO组的MDA水平低于IRI组(P＜0.05)。6．在热缺血和冷缺血模型中，IPO组和IRI组的肝脏细胞Fas阳性表达面积百分率都明显高于Sham组(P＜0.01)，并且IPO组的Fas阳性表达面积百分率低于IRI组(P＜0.05)。7．在热缺血和冷缺血模型中，IPO组和IRI组的肝脏细胞凋亡率都明显高于Sham组(P＜0.01)，并且IPO组的AI低于IRI组(P＜0.05)。结论1．缺血后处理对肝脏的冷／热缺血再灌注损伤及细胞凋亡具有一定的保护作用。2．缺血后处理通过抑制中性粒细胞的聚集；减少SOD失活，从而清除氧自由基；减少炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的释放来发挥其对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。3．缺血后处理通过减少炎性细胞因子的释放，清除氧自由基，抑制促凋亡基因Fas的表达来减轻肝脏冷／热缺血再灌注后的细胞凋亡。第二部分IPO、IPC、IPC-IPO对肝脏缺血再灌注损伤和细胞凋亡保护作用的对比研究研究目的对比研究缺血后处理(IPO)与缺血预处理(IPC)对肝脏缺血再灌注损伤和细胞凋亡的保护作用；并分析缺血后处理与缺血预处理联合应用(IPC—IPO)是否能更为有效的减轻肝脏冷／热缺血再灌注损伤。研究方法参照Nauta等所描述的方法建立大鼠部分肝脏30分钟热缺血模型，并根据Kamada等所描述的方法进行大鼠肝移植手术来建立肝脏2小时冷缺血模型。热缺血和冷缺血模型各分为4组：IRI组：单纯30分钟热缺血或2小时冷缺血后再灌注，无其它干预；IPC组：在冷／热缺血开始前，给予1个循环的“5分钟缺血-5分钟再灌注”的缺血预处理；IPO组：结束冷／热缺血后，在开始长时间灌注的起始阶段，给予3个循环的“30秒灌注30秒再缺血”缺血后处理；IPC-IPO组：在冷／热缺血开始前，给予1个循环的“5分钟缺血-5分钟再灌注”缺血预处理，并且在结束冷／热缺血后，在开始长时间灌注的起始阶段，给予3个循环的“30秒灌注-30秒再缺血”缺血后处理。各组一半动物在再灌注后3小时后，采集样本检测血清AST、ALT水平，胆汁葡萄糖含量、GGT水平，肝脏组织学及超微结构改变，采用双抗体夹心ABC-ELISA法，检测血清中肿瘤坏死因子Q(TNF-α)，白介素-1β(IL-1β)含量；采用化学比色法测定肝组织中丙二醛(MDA)含量，黄嘌呤氧化酶法测定肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用免疫组化检测检测肝细胞Fas基因的表达：流式细胞技术检测细胞凋亡。另外一半动物观察术后一周生存率。并对同一模型中各组的结果进行对比性分析。研究结果1．在热缺血和冷缺血模型中，干预组(IPC组、IPO组、IPC-IPO组)的ALT和AST水平明显低于IRI组(P＜0.05)。IPC组与IPO组的ALT和AST水平相当(P＞0.05)，IPC-IPO组与IPC组、IPO组相比，转氨酶水平也无明显差异(P＞0.05)。2．在热缺血和冷缺血模型中，干预组(IPC组、IPO组、IPC-IPO组)的胆汁葡萄糖和GGT水平都明显低于IRI组(P＜0.05)。IPC组与IPO组的胆汁葡萄糖和GGT水平差异无统计学意义(P＞0.05)。在肝脏热缺血模型中，IPC-IPO组与IPC组、IPO组相比，胆汁葡萄糖和GGT水平也无明显差异(P＞0.05)；在冷缺血缺血模型中，IPC-IPO组与IPC组、IPO组相比，胆汁葡萄糖水平接近(P＞0.05)，但GGT水平存在统计学差异(P＜0.05)。3．在热缺血和冷缺血模型中，IRI组肝脏组织学改变及中性粒细胞的聚集最为严重；IPC组、IPO组及IPC-IPO组肝脏组织学改变及中性粒细胞的聚集较轻，且程度相当。4．在热缺血和冷缺血模型中，干预组(IPC组、IPO组、IPC-IPO组)的TNF-α及IL-1β水平都明显低于IRI组(P＜0.05)。IPC组、IPO组与IPC-IPO组的TNF-α及IL－1β水平差异无统计学意义(P＞0.05)。5．在热缺血和冷缺血模型中，干预组(IPC组、IPO组、IPC－IPO组)的SOD水平都明显高于IRI组(P＜0.05)。IPC组、IP0组与PC-IPO组的SOD水平差异无统计学意义(P＞0.05)。在冷缺血和热缺血模型中，干预组(IPC组、IPO组、IPC-IPO组)的MDA水平都明显低于IRI(P＜0.05)。IPC组、IPO组与IPC-IPO组的MDA水平差异无统计学意义(P＞0.05)。6．在热缺血模型中，干预组(IPC组、IPO组、IPC-IPO组)的肝脏细胞Fas阳性表达面积百分率都明显低于IRI组(P＜0.01)；在冷缺血模型中，干预组的肝脏Fas阳性表达面积百分率都低于IRI组(P＜0.05)。在两种模型中，各干预组Fas阳性表达面积百分率无统计学差异(P＞0.05)。7．在热缺血及冷缺血模型中，干预组(IPC组、IPO组、IPC-IPO组)的肝脏细胞凋亡率都低于IRI组(P＜0.05)，且IPC组、IPO组与IPC-IPO组的细胞凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05)。8．在热缺血模型中，IPC组、IPO组、IPC-IPO组的一周生存率分别为87.5％(7／8)，75％(6／8)和87.5％(7／8)，三组间比较无统计学差异(P＞0.05)，但三组的一周生存率都高于IRI组(37.5％，3／8，P＜0.05)。在冷缺血模型中，IRI组一周生存率为25％(2／8)，低于IPC组(62.5％，5／8)、IPO组(75％，6／8)、IPC-IPO组(87.5％，7／8)(P＜0.05)；干预组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论1．IPO和IPC对肝脏的冷／热缺血再灌注损伤及细胞凋亡都具有保护作用，且两者的保护作用无显著差异。2．IPO与IPC都可通过抑制中性粒细胞的聚集；减少炎性细胞因子TNF-α，IL-1β的释放；减少超氧化物歧化酶失活，从而清除氧自由基；抑制促凋亡基因Fas的表达来发挥保护作用。且各种保护机制在IPO与IPC发挥的作用相当。3．IPC与IPO联合应用对大鼠肝脏的冷／热缺血再灌注损伤和细胞凋亡的保护作用无叠加效应，IPC-IPO的保护作用与单独IPC或IPO相比无明显加强。