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【背景】颅骨锁骨发育不良（cleidocranial dysplasia,CCD）是一种先天性骨骼系统的发育畸形,是罕见的常染色体显性遗传病。其主要临床特征包括颅骨缝合线持续开放,骨肿胀,颅骨和（或）锁骨发育不全,齿列异常等,影响生活质量。研究表明,CCD的病因为位于第6染色体p21上的runt-related transcription factor 2（RUNX2）基因发生突变,RUNX2基因主要参与成骨细胞的分化和软骨细胞的成熟过程,但CCD致病的具体分子机制尚未阐明。软骨发育不全（achondroplasia,ACH）是一种由于成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3）基因突变引起的常染色体显性遗传病,是临床上最为常见的先天性侏儒。ACH的临床特征主要包括不成比例的身材矮小、塌鼻梁、前额突出、“三叉戟”样的短小手指等,ACH患者智力一般不受影响。研究表明,FGFR3基因的突变通过抑制软骨细胞的增殖和分化,进而导致ACH的发生。ACH增加了新生儿出生缺陷率,新生儿、儿童及成人的致残率,同时诸多的合并症也严重地影响了患者的生存质量,加重其家庭负担。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）是一种通过利用转录因子重编程哺乳动物成体细胞,使其脱分化形成的多能干细胞。iPSC与胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）的生理学特性相似,都具备一定的再生分化能力,但与ESC相比,iPSC面临的伦理道德争议较小且可在一定程度上规避了排异风险,因此在医学领域具有广阔的应用前景。同时,患者来源的iPSC亦被认为是良好的疾病细胞模型的选择,现已在疾病建模、机制研究、药物筛选、再生医学等领域的研究中广泛使用。本研究首先从RUNX2基因3号外显子杂合缺失的CCD胎儿和FGFR3基因发生c.1138G>A（p.Gly380Arg）错义突变的ACH胎儿的脐带血中提取出外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）,并通过电转法将表达四种转录因子OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4的非整合型诱导质粒（内含p EV-SFFV-OCT4-E2A-SOX2、p EV-SFFV-MYC-E2A-KLF4和p EV-SFFV-BCL-XL）分别转导入两组PBMC中,诱导其重编程为CCD胎儿来源iPSC（登记号:GZHMCi003-A）和ACH胎儿来源iPSC（登记号:GZHMCi004-A）,最后对两组iPSC进行鉴定。【实验目的】构建并鉴定CCD和ACH胎儿脐带血来源的iPSC细胞系,为后续CCD和ACH的疾病分子机制、新药筛选和干细胞治疗等研究提供细胞模型,为下一步构建CCD和ACH患者来源疾病骨软骨类器官模型提供实验基础。【实验方法】1.样本收集:在接受产前诊断的病例中,选取一含有RUNX2基因突变的CCD胎儿及一含有FGFR3基因突变的ACH胎儿,在经过孕妇及其家属的知情同意后,分别采集两例胎儿终止妊娠时的脐带血样本,分离出PBMC进行传代培养。2.实验方法:通过电转法将表达四种转录因子OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4的非整合型诱导质粒（内含p EV-SFFV-OCT4-E2A-SOX2、p EV-SFFV-MYC-E2A-KLF4和p EV-SFFV-BCL-XL）分别转导入RUNX2基因3号外显子杂合缺失的CCD胎儿和FGFR3基因发生c.1138G>A（p.Gly380Arg）错义突变的ACH胎儿的脐带血PBMC中,诱导其重编程为GZHMCi003-A和GZHMCi004-A并建系。3.验证方法:通过染色体核型分析,STR分析和一代测序鉴定GZHMCi003-A和GZHMCi004-A与其来源PBMC是否存在遗传学差异,通过免疫荧光染色、RT-qPCR及体外三胚层定向分化实验证实GZHMCi003-A和GZHMCi004-A的多向分化潜能。【结果】本研究成功构建了CCD胎儿来源的GZHMCi003-A细胞系及ACH胎儿来源的GZHMCi004-A细胞系。通过染色体核型分析、STR分析和一代测序证实GZHMCi003-A和GZHMCi004-A分别来源于CCD及ACH胎儿脐带血PBMC。GZHMCi003-A和GZHMCi004-A的碱性磷酸酶（AP）染色结果呈阳性;免疫荧光染色实验表明两者均能表达多能性标志物NANOG、OCT4、SOX2和TRA-1-60;体外三胚层定向分化实验、RT-qPCR和免疫荧光染色实验表明GZHMCi003-A和GZHMCi004-A均具备分化成为三个不同胚层的潜能。PCR证实GZHMCi003-A和GZHMCi004-A无支原体感染。【结论】通过利用非整合型诱导质粒,可以将CCD和ACH胎儿来源的脐带血PBMC诱导重编程为iPSC且具备多向分化潜能,可为CCD和ACH的疾病分子机制、新药筛选和干细胞治疗等研究提供良好的疾病细胞模型,亦可为下一步构建CCD和ACH患者来源疾病骨软骨类器官模型提供实验基础。