人表皮生长因子(hEGF)是一个含有53个氨基酸残基的单链多肽，分子量6045dal，等电点4.6，含有3个链内二硫键，均为其生物活性所必须，无游离巯基存在。hEGF分子的C端为促细胞增殖的活性功能区，N端则具有结合功能。hEGF广泛分布于全身各组织及器官，可在颌下腺、十二指肠、肾脏、胰腺、乳腺、角膜、卵巢、睾丸、前列腺、肝脏、神经元、星形细胞等多种组织及器官中合成，对细胞起重要的保护作用。在临床上可用于促进创伤、烧伤及烫伤的愈合，消化道及泌尿道损伤的修复，以及皮肤的保护及美容。但hEGF的来源有限，以往多从人尿中提取，人尿中含量甚微10万公升人尿才能提取1g hEGF，又存在失活及污染等问题。近年来利用生物工程方法生产hEGF但往往以包涵体形式表达，而活性较低或无活性。通过变性复性等复杂过程有活性但收率极低。克隆表达大量的有生物活性的产品非常困难，且不稳定。本课题用基因工程技术，成功地克隆构建了hEGF分泌型表达载体。它有如下特点：1．OmpA起始位点与核糖体结合位点之间只相隔5个核苷酸有利于转录和翻译；2．OmpA与T7启动子串联使目的基因在E.coli中得到高效稳定的表达；3．表达的目的蛋白与OmpA之间增加了不带电荷的甘氨酸和丝氨酸2个小的氨基酸残基，使OmpA和目的蛋白之间更具有柔性，便于信号肽酶切除OmpA；4．利用OmpA信号肽可使外源基因产物直接分泌到Ecoli周质腔，对那些在胞内表达且表达产物对细胞有毒性的外源基因来说，可能会减弱其毒性、提高其表达量；5．周质腔蛋白酶活性低于胞内，有助于融合蛋白的稳定性；6．周质腔内其它蛋白含量少，所表达的蛋白通过软件分析占菌体蛋白的60％以上。为了赋予hEGF新的特性，我们克隆表达的hEGF变体N端融合了转导肽序列，使其能够穿越细胞膜并且能够通过血脑屏障。为脑神经退行性疾病的治疗研究提供可能性。众所周知，脑内神经元和星形胶质细胞均可表达EGF。EGF参与神经前体细胞增殖及细胞的生存和迁移，对神经元细胞再生具有直接和间接作用。EGF对胆碱能和多巴胺神经元等中枢神经系统还具有神经营养作用。EGF也可以通过支持和诱导神经元胞体及神经胶质细胞间接途径分泌神经生长因子(NGF)来促进神经细胞再生。此外，EGF还是一种脑肠肽神经递质。但自然状态下的EGF很难通过血脑屏障。目前EGF作用脑中枢神经系统的实验研究普遍采用麻醉状态下脑渗透泵注入的方法。麻醉抑制动物脑神经，渗透泵注入会伤害动物脑，很难模拟自然状态下EGF作用动物脑神经的真实情况，也很难用于临床。本实验表达的hEGF变体能够通过血脑屏障，为治疗神经系统疾病奠定了基础。对其生物活性进行了研究，水迷宫及穿梭箱实验惊喜地发现hEGF变体能够改善AD模型鼠及自然老化鼠的学习记忆能力；海马神经干细胞检测，证明具有促海马神经干细胞增殖作用；PET实验证明能显著增加葡萄糖代谢；以上结果都表明hEGF变体对实验性小鼠及大鼠阿尔采默病有治疗功效。此外hEGF变体，对酒精伤害的胃粘膜有明显的预防和治疗作用。hEGF变体对皮肤及细胞膜的穿越能力优于hEGF自身。hEGF的改构从而使老药EGF有了新的实用性研发前景。本课题的创新点：1．成功地进行了PTD-hEGF分泌型表达载体的构建，并在原核细胞中完成了有生物活性的可溶性表达。2．重组成功了比hEGF有更强的细胞膜穿透力的PTD-hEGF。其显著特点是解决了hEGF穿越血脑屏障的难题。3．解决了经直肠给入PTD-hEGF的非侵入性给药途径问题，为人用舌下含服制剂的研发开辟了道路，增强用药安全性及患者依从性。