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第一部分:Drosha非依赖性microRNA6778-5p的产生机制及其对胃癌干细胞的影响目的:课题组前期在胃癌细胞中敲除Drosha发现胃癌细胞存在异常升高的非经典miRNA,并且Drosha的敲除并未完全逆转胃癌的恶性特征。鉴于非经典miRNA在Drosha缺失的胃癌细胞中的异常表达,我们想知道是否这些Drosha非依赖的miRNA异常升高,在Drosha沉默的胃癌细胞恶性行为(如胃癌干细胞维持)中发挥着重要作用?因此,我们研究目的是:(1)探讨miR6778-5p是否为Drosha非依赖性不典型microRNA。(2)探讨miR6778-5p的产生机制。(3)探讨miR6778-5p对胃癌干细胞的影响。方法:(1)Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)验证课题组前期针对MGC-803/野生型(MGC-803/WT)与MGC-803/Drosha敲低(MGC-803/Drosha KD)的胃癌细胞芯片数据。(2)运用生物信息学对候选miRNA进行分析筛选。运用UCSC Genome Browser Home数据库寻找候选miRNA的宿主基因。(3)qRT-PCR检测不同Drosha敲低胃癌细胞系中候选miRNA和其宿主基因的表达情况。(4)构建宿主基因中含有候选miRNA序列的内含子加上跨越的两个外显子序列的野生型(WT)及相应剪接位点突变型质粒(MUT)。(5)Real-time PCR(RT-PCR)验证宿主基因剪接突变情况,qRT-PCR验证宿主基因突变后miRNA的表达情况。(6)合成miR6778-5p成熟序列并重组到过表达病毒载体上构建miR6778-5p过表达病毒;设计靶向miR6778-5p的干扰序列并重组到慢病毒载体以构建miR6778-5p敲低病毒。(7)将过表达及敲低病毒分别转染至胃癌Drosha野生型细胞(MGC-803/Drosha WT和SGC-7901/Drosha WT)和胃癌Drosha敲低细胞(MGC-803/Drosha KD和SGC-7901/Drosha KD),建立miR6778-5p过表达及敲低的稳定细胞株。(8)qRT-PCR验证胃癌组织及相应癌旁组织中Drosha、CD44及miR6778-5p的表达情况。(9)培养胃癌干细胞,观察各过表达及敲低细胞株的干细胞成球能力的变化。(10)皮下注射MGC-803胃癌Drosha敲低干细胞(MGC-803/Drosha KD)、MGC-803胃癌Drosha及miR6778-5p双敲低干细胞(MGC-803/Drosha KD/miR6778-5p KD),观察体内成瘤能力。结果:qRT-PCR证实MGC-803/Drosha KD胃癌细胞中存在异常升高的microRNAs,且发现miR6778-5P增高最明显。经生物信息学分析,miR6778-5p可能为非典型的miRNA,即属于5’-tailmirtron亚型miRNA,并且miR6778-5p是由SHMT1的5号内含子的剪接形成;将剪接位点突变后,发现miR6778-5p的表达量明显降低。成功构建miR6778-5p过表达和敲低的细胞株。在低/高表达的Drosha的胃肿瘤中,CD44表达量无明显变化;与Drosha高表达的胃肿瘤相比,Drosha低表达的胃肿瘤中miR6778-5p表达量更高。与Drosha野生型相比,在Drosha敲低的细胞中再次敲低miR6778-5p,会明显降低干细胞成球能力下降更为显著;相反地,在Drosha野生型细胞中过表达miR6778-5p则增强了胃癌干细胞的成球能力。体内数据证实:同时敲低Drosha与miR6778-5p表达的胃癌干细胞(Gastric cancer stem cell,GCSC),会显著降低其体内成瘤能力。结论:在胃癌细胞中,Drosha的沉默或低表达导致非典型的miRNA(e.g.miR6778-5p)的形成;miR6778-5p是来源于其主基因SHMT1的5号内含子的异常剪接,属于5’tail mirtron类非经典miRNA。miR6778-5p可维持胃癌干细胞干性。第二部分:microRNA6778-5p影响胃癌干细胞干性的分子机制目的:探讨miRNA6778-5p维持胃癌干细胞干性的分子机制。方法:(1)生物信息学寻找miRNA6778-5p的靶基因,并与芯片中下调的基因取交集;Quantitative Real-time PCR(q RT-PCR)验证胃癌Drosha敲低细胞中候选靶基因的mRNA水平。(2)荧光素酶报告基因及q RT-PCR实验验证miR6778-5p对靶基因的调控作用;Westernblot(WB)实验验证将miR6778-5p过表达及敲低后靶基因的蛋白表达变化。(3)分别在Drosha野生型和Drosha敲低的胃癌细胞中敲低或过表达靶基因,培养干细胞,观察干细胞成球能力。(4)分别在Drosha野生型和Drosha敲低的胃癌细胞中过表达或敲低丝氨酸羟甲基转移酶1(SHMT1),培养干细胞,观察干细胞成球能力。(5)查阅文献及实验验证miR6778-5p对SHMT1的反馈调控作用。(6)用丝氨酸处理胃癌干细胞,观察相应干细胞成球能力。运用同位素追踪的方法,观察线粒体及胞质一碳代谢在胃癌细胞中的转化情况。(7)q RT-PCR验证胃癌组织及癌旁组织、5-FU敏感性胃癌组织及5-FU耐受性胃癌组织中miR6778-5p,SHMT1及CD44的表达情况。(8)用5-FU处理胃癌干细胞,观察相应干细胞的成球能力。(9)皮下注射相应胃癌干细胞,观察体内成瘤能力。结果:筛选出的靶基因为YWHAE,且实验证实miR6778-5p靶向调控YWHAE。YWHAE抑制胃癌干细胞(GCSC)成球能力而SHMT1会增强胃癌干细胞成球能力。文献及实验验证了miR778-5p可通过靶向抑制YWHAE来正向调控SHMT1。丝氨酸的补充恢复了GCSC的成球能力。同位素追踪实验显示在Drosha野生型GCSC中检测到更多的10-甲酰基-THF和M+1 d TTP,而在Drosha KDGCSC中则检测到更多的N5,N10-亚甲基四氢叶酸(5,10-m THF)和M+2 d TTP;在Drosha野生型GCSC中敲低丝氨酸羟甲基转移酶2(SHMT2)可降低M+1 d TTP,而在Drosha敲低GCSC中敲低miR6778-5p,SHMT1或SHMT2均未影响M+1 d TTP。相反,miR6778-5p,SHMT1或SHMT2的丢失对Drosha野生型GCSC中的M+2 d TTP几乎没有影响,但敲低miR6778-5p或SHMT1,则显着降低了Drosha敲低GCSC的M+2 d TTP。与5-FU敏感的肿瘤相比,在5-FU耐受性胃肿瘤中可检测到更高水平的miR6778-5p,SHMT1和CD44。与Drosha野生型GCSC相比,Drosha敲低型GCSC对5-FU的耐受性更强;Drosha胃癌细胞与仅用在5-FU处理相比,同时敲低SHMT2时会显着降低Drosha野生型GCSC成球能力;相反,与仅用5-FU处相比,同时敲低miR6778-5p或SHMT1则显着降低Drosha敲低型GCSC成球能力。结论:miR6778-5p可通过靶向YWHAE正向调控其宿主基因SHMT1的表达,进而影响胃癌干细胞的形成。在Drosha KD胃癌细胞中miR6778-5p-SHMT1信号轴介导的胞质一碳代谢有助于胃癌干细胞的干性维持。