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神经系统损伤后的再生与修复是神经组织工程中倍受关注的问题。相比于直接修复、自体/异体神经移植等治疗方法,神经支架为解决神经来源有限、移植成功率低、排斥反应严重和修复范围不广等难题带来了新希望。作为神经组织工程的应用主体,神经支架为神经再生与修复提供了最佳的生物微环境,支持细胞粘附增殖,引导细胞分化迁移,减轻细胞炎症反应,达到促进神经细胞再生与神经组织修复的目的。角蛋白是具有临床应用前景的功能型神经支架材料,它来源天然取材丰富、免疫原性低、降解吸收性好。但角蛋白粘度低极性小、成纺性较差,这使得制备单一角蛋白支架十分困难。前期研究中,已有学者将多种生物材料与角蛋白混合共纺纳米纤维用于组织工程,但角蛋白与其他材料混纺会影响纤维的力学性能,并且混纺的复合纳米纤维表面不能保证角蛋白覆盖,这也影响了角蛋白混合纤维的生物性能。基于此,本课题使用静电纺丝技术制备了表面负载角蛋白纳米颗粒的聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol,PVA)复合纤维支架(Keratose Nanoparticles-coated-PVA fibers,KosNPs/PVA)用于神经细胞培养,角蛋白/PVA混合纤维支架(KOS/PVA composite fibers,KOS/PVA)在本研究中也进行制备作为对照。KosNPs/PVA支架由PVA纤维作为骨架,并且表面附着角蛋白纳米颗粒,与KOS/PVA纳米纤维相比更具有增强细胞相容性的潜力。主要研究内容和结论:1.采用氧化法提取人发角蛋白,对氧化型角蛋白(Keratose,KOS)进行提取率、蛋白定性和氨基酸定量分析。(1)用该法成功提取KOS,SDS-PAGE电泳图显示蛋白分子量约为40kDa,与文献报道一致;(2)被检测出的氨基酸共17种,丝氨酸,谷氨酸和苏氨酸含量相对较高;(3)氨基酸含量稳定在50%以上。说明氧化剂过氧乙酸选取合适,提取的蛋白可用于复合支架的制备。2.利用静电纺丝技术制备角蛋白复合支架,对微观结构形态及生物学性能进行考察。(1)按照一定配比(KOS:PVA=1:2.5,1:5,1:7.5,1:10),成功制备KosNPs/PVA和KOS/PVA;(2)SEM表征结果发现:KosNPs/PVA中的角蛋白纳米颗粒呈球形附着于纤维上,形成了纳米颗粒附着纤维的微观结构,底层纤维相互交叠,因而支架具有高度联通的多孔结构。同时,KOS/PVA也具有典型的纤维结构。(3)FTIR和XRD测试结果发现:通过静电纺丝技术制备两种不同结构复合神经支架对KOS和PVA的化学结构与晶型没有明显影响;(4)水接触角结果发现,复合支架具有强亲水性,且随着角蛋白含量的增加而亲水性显著增加。KosNPs/PVA 1:10 1:7.5 1:51:2.5组的接触角分别为25.1±1.8o,23.2±1.3o,17.1±1.9o,15.7±2.0o,说明角蛋白表面亲水的酰胺基侧链和丝氨酸存在,增加了支架的亲水性,且纳米颗粒附着纤维的微观结构对其亲水性的增加没有显著影响;(5)力学性能结果发现,各组KosNPs/PVA的力学性能没有明显差异,与纯PVA纤维支架的力学性能接近,说明纳米粒附着纤维的微观结构没有影响纤维的力学性能。但KOS/PVA复合支架的拉伸强度和杨氏模量与KosNPs/PVA相比较高。3.综合上述表征结果,本研究选取KosNPs/PVA 1:7.5,1:5组作为实验组,KOS/PVA 1:7.5,1:5组作为对照组,考察不同类型角蛋白复合支架的细胞相容性。分别选用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞和大鼠C6神经胶质瘤细胞模拟神经元和神经胶质细胞发育模型,考察细胞粘附、生长增殖情况以及NCAM、GAP-43、MAP-2、GFAP基因的表达。(1)细胞形态结果表明,两种角蛋白复合支架能很好的支持细胞生长,但PC12细胞和C6细胞在KosNPs/PVA上显示出更好的生长活力,说明纤维表面角蛋白纳米颗粒的附着可促进细胞生长;(2)粘附结果表明,PC12细胞粘附力依次是KOS/PVA组>KosNPs/PVA组>PVA组,C6细胞是KosNPs/PVA组>KOS/PVA组>PVA组,说明角蛋白在纤维表面的包覆有助于细胞的粘附,但C6细胞对角蛋白的响应更敏感;(3)增殖结果表明,0-24h内,各组支架培养的PC12、C6细胞增殖活力没有明显差异。24-48h内,KosNPs/PVA组支架上的细胞增殖活力加强,细胞数量增多。说明纤维表面的角蛋白有营养、支持细胞生长的作用。(4)基因表达结果表明,与KOS/PVA相比,KosNPs/PVA复合支架可以上调PC12细胞的NCAM、GAP-43、MAP-2的表达,能增强细胞与支架材料的粘附,促进微管结构的稳定,有利于细胞的生长发育。KosNPs/PVA组的C6细胞NCAM、GAP-43基因表达也呈上调趋势,说明KosNPs/PVA与KOS/PVA相比对细胞具有更优的支持和稳定生长的作用。