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[研究背景]肝细胞肝癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）是世界范围内十大恶性肿瘤之一，约80％的肝细胞肝癌的发生是由乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)感染引起，其发病率高，死亡率高，严重危害人们的健康，目前早期诊断除B超、CT等影像学检查外，甲胎蛋白(AFP)是最常用的检测手段，但有时出现漏诊和误诊，并且乙型肝炎相关性肝癌尚无满意的治疗，因此研究HBV感染引起的肝细胞肝癌的发生机制具有重要意义。而microRNAs(miRNAs)的发现及其功能和调控机制的阐明为这一问题的解决带来了新的契机。
miRNAs是一类真核生物中长约19-22nt的单链非编码小RNA，成熟的miRNA可通过与其靶基因mRNA特异结合和（或）干预靶蛋白翻译过程来调节靶基因的表达，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等多个生命活动。近年来，miRNA在人类肿瘤中的表达和意义已日益成为研究热点，越来越多的研究表明，miRNA通过调控靶基因参与的信号通路，在肝细胞肝癌的发生和发展过程中起着非常重要的作用。大量研究证实miR-34家族分子具有抑制细胞生长和促进细胞凋亡的功能，在肿瘤细胞中显著低表达。但是miR-34c在肝细胞肝癌中的表达仍有较大争议，许多研究报道miR-34c在肝癌细胞中表达下降，而其高表达可抑制细胞增殖促进细胞凋亡;尽管如此，也有报道显示miR-34c在肝癌细胞中高表达，这可能与肝细胞肝癌的致病因素有关。至于由HBV感染引起的肝细胞肝癌中miR-34c的表达情况尚无明确研究。本课题组前期利用miRNA芯片研究发现，在不同时期HBV转基因小鼠肝脏中，miR-34c表达水平显著下降，提示miR-34c可能直接或间接参与了HBV相关性肝癌的发生，因此研究miR-34c与HBV感染和肝细胞肝癌发生的关系意义重大。在前期工作的基础上，本课题就miR-34c对HBV感染及其相关性肝癌的调控机制展开研究。
[研究目的]明确miR-34c的直接靶基因，检测miR-34c及其靶基因在HBV相关性肝癌中的表达水平;构建miR-34c的表达载体，为后续试验提供基础。通过体外转染miR-34c的表达载体，研究miR-34c对靶基因的调控作用，miR-34c对HBVDNA复制、抗原表达以及对肝癌细胞增殖凋亡的影响;通过体内实验观察miR-34c对异种移植肝癌细胞生长的影响。探讨miR-34c在HBV感染相关性肝癌发生发展中的作用机制。
[研究方法]首先在肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15、BEL7402和HBV转染BEL7402，以及相对应的HBV相关性肝癌组织和正常肝脏组织中，通过qRT-PCR方法检测miR-34c的表达变化，进一步验证前期芯片结果;其次利用生物信息学方法初步筛选miR-34c的靶基因，并在相同肝癌细胞系和临床标本中，通过RT-PCR方法进一步筛选并锁定miR-34c的靶基因TGIF2，构建miR-34c的表达载体和TGIF2的3-UTR荧光载体，通过双荧光报告分析验证miR-34c与TGIF2的直接靶向调控关系;体外转染miR-34c的表达载体，通过RT-PCR/qPCR和Westernblot分别检测转染前后TGIF2mRNA和蛋白的表达水平，通过HBVDNAqPCR和ELISA分别检测HBVDNA的复制以及HBsAg和HBeAg的表达水平，并通过CCK-8和流式细胞技术分别检测细胞的增殖和凋亡情况;异种移植HepG2.2.15细胞构建裸鼠肝癌模型，通过瘤内注射miR-34c表达载体，观察miR-34c对肝癌细胞生长的影响。
[研究结果]qRT-PCR结果显示miR-34c在HBV相关性肝癌组织、HepG2.2.15细胞以及HBV转染BEL7402细胞中表达水平明显下降，与前期芯片结果一致;生物信息学预测、qRT-PCR筛选和双荧光报告鉴定结果证实TGIF2是miR-34c的直接靶基因，miR-34c通过作用于TGIF2mRNA3-UTR区抑制其表达;在HepG2.2.15肝癌细胞中过表达miR-34c后，RT-PCR和Westernblotting结果分别显示TGIF2在mRNA和蛋白水平上表达明显下降;HBVDNAqPCR和ELISA结果分别显示HBVDNA拷贝数目以及HBsAg和HBeAg的分泌含量明显减少;CCK-8和流式细胞技术结果显示miR-34c的过表达可抑制HepG2.2.15细胞的增殖，并促进HepG2.2.15细胞的凋亡;成功构建裸鼠肝癌模型后，瘤内注射miR-34c的表达载体后裸鼠肿瘤生长受到抑制，与对照组相比，其肿瘤体积明显减小。
[结论和意义]通过本研究我们明确了miR-34c在HBV相关性肝癌细胞中低表达。证实了在HBV相关性肝癌的发生过程中，miR-34c的直接调控靶基因之一是TGIF2，miR-34c的过表达可在mRNA转录后和蛋白翻译水平上抑制TGIF2的表达。另外观察到miR-34c的过表达可以抑制HBVDNA的复制以及表面抗原和e抗原的表达，为miRNA和HBV感染相互作用机制的研究提供了理论基础。miR-34c还可以抑制肝癌细胞增殖促进肝癌细胞凋亡，并且在动物试验中，miR-34c可以抑制肿瘤的生长。通过本研究表明miR-34c通过调控TGIF2参与了HBV感染相关性肝癌的发生发展过程。miR-34c可作为抑制HBV感染和防止肝癌发生的调控分子，从而为临床预防、诊断和治疗提供理论和实验依据。