论文部分内容阅读
A型塞内卡病毒(SenecavirusA,SVA)是小核糖核酸病毒科,Senecavirus属的唯一成员。SVA感染引起新生仔猪跛行、嗜睡、厌食、急性死亡及特征性水疱病症状。目前已有加拿大、哥伦比亚、美国、巴西、中国、越南、泰国等多个国家报道了 SVA疫情。2015年以来,我国广东、湖北、福建、湖北等14个省份相继暴发SVA疫情。研究表明目前国内流行的SVA毒株正在发生变异,部分毒株已发生重组。最新研究发现SVA似乎获得了比以前更强的致病性和传播能力。然而,中国SVA毒株的流行病学信息还有待补充,特别是SVA致病性毒株的信息仍然非常缺乏。因此,本研究分离鉴定了两株中国的SVA毒株,从亲缘关系、基因组水平以及致病性上分析毒株的差异。制备了能够特异性识别VP3蛋白的单克隆抗体,并鉴定其抗原表位,为SVA新型诊断试剂的研制和该病毒的有关研究工作提供了有力的免疫学工具。具体内容如下:1 A型塞内卡病毒的分离鉴定、基因组测序及遗传进化分析本研究对2017～2018年来自广东若干生猪养殖场的疑似病料进行病毒分离与全基因组测序,并将分离的2株SVA毒株命名为GD04/2017和GD-S5/2018(GenBank登录号:MH316113、MK463618)。病毒生长曲线分析显示两个毒株具有相似的动力学曲线特征,GD-S5/2018毒株的病毒滴度略高于GD04/2017毒株。空斑实验显示两个毒株均能在猪源细胞系上形成可见的空斑,GD-S5/2018毒株形成的空斑略大,与病毒生长曲线结果一致。将本研究分离毒株GD-S5/2018、GD04/2017与美国分离的致病性毒株SVA SD15-26、原型毒株SVV-001进行ORF基因组和多肽序列的分析比较。基于ORF和VP1编码区序列的系统发育树分析,结果显示GD-S5/2018和SVA SD15-26属于同一遗传分支,GD04/2017属于另一个分支,而SVV-001与所有其他SVA毒株亲缘关系最远。GD-S5/2018与SVASD15-26毒株显示出最高的氨基酸相似性,提示两个毒株在致病性上或存在相似。GD04/2017株在5’ UTR的第290位有一个核苷酸的插入,299-309位核苷酸有11个核苷酸的较大插入,这是首次报道SVA 5’UTR区存在一段核苷酸插入。2 A型塞内卡病毒分离毒株的致病性分析为了研究分离的SVA毒株(GD-S5/2018和GD04/2017)的致病性,进行了猪体攻毒实验。结果表明,2株SVA毒株均成功感染所有猪只。在GD-S5/2018毒株感染组的猪只中观察到舌头和牙龈上的水疱及溃疡性病变等特征性临床症状。然而,GD04/2017毒株感染组猪只除了表现出萎靡不振外,没有观察到其它临床症状。在感染后1-3天内,GD-S5/2018感染组鼻拭子中的病毒含量高于GD04/2017感染组。在感染后1-6内,GD-S5/2018组的体温高于GD04/2017组。将病毒感染组的猪血清与GD04/2017、GD-S5/2018、GD05/2017进行同源与异源地中和,结果显示各毒株均引起猪体高水平的中和抗体反应。同源毒株感染组的猪血清针对同源毒株的中和抗体水平高于异源毒株,揭示了 SVA毒株之间存在抗原性差异,在未来的SVA流行病学研究中这种差异值得关注。3 A型塞内卡病毒VP3蛋白单抗的制备及其抗原表位鉴定本研究将截短的VP3片段序列插入pCold Ⅱ原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达得到目的融合蛋白。将纯化后的蛋白免疫小鼠,三次免疫后小鼠多抗血清IFA检测结果为阳性。然后,将小鼠脾淋巴细胞与杂交瘤经细胞融合,通过阳性筛选及亚克隆获得能够稳定分泌针对SVAVP3蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。Western Blot与IFA试验结果表明,该腹水单抗能特异性地识别SVAVP3蛋白。进一步,对该单抗识别的抗原表位进行鉴定。将抗原蛋白的基因序列在真核细胞中进行分段表达,然后利用Western Blot鉴定单克隆抗体能够识别的最小片段。结果显示,单抗识别SVAVP3蛋白的第191-201位氨基酸序列(191DGWFSLHKLTK201),该表位序列在所有SVA毒株VP3蛋白中高度保守。SVA VP3蛋白单克隆抗体的成功制备与抗原表位的精确鉴定,为SVA新型诊断试剂的研制和该病毒的有关研究工作提供了有力的免疫学工具。