[背景]随着全球经济的发展,人民生活水平不断提高,大家在享受丰富物质生活带来的便利时,面临的健康威胁也日益严重。糖尿病(diabetes mellitus, DM)正是在这样一个生活方式现代化而人口老龄化的时代以惊人的速度攀升,成为患病率、致残率及死亡率仅次于肿瘤和心血管疾病成为第三大慢性非传染病,给社会公共健康带来严峻的考验。如若不控制糖尿病发病率逐年增长的势头,预计到2050年,全球糖尿病患者数量将有一到两倍的增加,同时由DM病程进展所致的各种慢性并发症包括糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)、糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)、糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)、糖尿病心脑血管并发症等也将大幅度增长,从而带来难以预计的社会及经济负担。糖尿病肾病作为糖尿病特有的慢性微血管并发症,现今己成为糖尿病最常见的慢性并发症之一,也是目前欧美终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)最常见的病因,严重威胁着人类的健康。据统计,目前约30%的1型糖尿病及20%～50%的2型糖尿病患者发生肾脏损害,而进展至ESRD的患者5年生存率将小于20%。DN早期的病理改变包括细胞外基质合成增多和排除减少导致的肾小球基底膜增厚、细胞外基质沉积和系膜细胞增生所致的系膜区扩张以及足细胞损害和数量的减少,加上肾小管间质扩张和小管间质细胞外基质积聚,随即会出现蛋白尿及肾小球滤过率的降低,从而共同加剧肾小球硬化及肾小管间质纤维化,最终进展为ESRD.肾小球的病理变化主要有三种类型,包括结节性肾小球硬化、弥漫性肾小球硬化和渗出性病变,其中以结节性肾小球硬化最具特征性,又将其称为毛细血管间肾小球硬化或Kimnel-Steil-Wilson结节(K-W结节)。由此可见,系膜细胞在糖尿病肾病发病初期就出现改变,并进一步引发疾病进展过程中的组织病理异常和功能障碍甚至衰竭,在DN的发生发展中充当着极为重要的角色。DN是由环境和遗传因素相互作用所致的多因素紊乱,确切的发病机制尚未完全阐明,目前研究发现较经典的机制概括来说主要包括两大方面,即代谢损伤和血流动力学损伤,具体来说有以下致病因素：1、高血糖引起的多种生化代谢异常,包括非酶糖基化作用的加强、多元醇通路和己糖胺生物合成通路的激活,以及葡萄糖直接改变细胞内信号通路而发挥的毒性作用等；2、高血压引起的肾小球损伤；3、蛋白尿影响,蛋白质的超负荷诱导小管间质损害,诱发促进硬化的细胞因子释放,从而促进疾病的进展；4、分子介质包括转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等的影响,以及转录因子和细胞内信号通路的参与；5、此外,DN被证实具有遗传易感性。近年来,学者们在上述经典的发病机制外,越来越关注“代谢性炎症”在DM及其慢性并发症中的参与程度,并致力于探索与DN相关的炎症因子和信号通路。关于炎症与代谢疾病相关研究最早始于二十世纪90年代,但直到2006年Hotamisiligil在《Nature》上才首次定义这一概念,并阐述了参与糖尿病及其慢性并发症的发生与发展,他指出代谢性炎症是指一种代谢诱发的长期而持续的低强度炎症反应,主要由长期的慢性营养过剩状态以及TNF-α过表达而使正常胰岛素信号通路受抑制所触发,虽然其临床症状有别于传统的急性炎症的表现包括红、肿、热、痛等,但其分子机制和信号通路与传统的炎症反应相类似。在这之后,越来越多的研究开始致力于炎症在糖尿病及其慢性并发症中参与程度和具体机制。有研究证实免疫介导的炎症反应是糖尿病肾病发生发展过程不可缺少的致病因素,参与其中的炎症细胞众多,包括白细胞、单核细胞、巨噬细胞等,而细胞因子更甚,包括单核细胞趋化因子(MCP-1)、细胞间粘附因子(ICAM-1)、转化生长因子β (TGF-β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素(IL)以及核因子-κB (NF-κB)等,这些细胞及细胞因子参与并贯穿疾病始末。再众多的细胞因子当中,MCP-1、TGF-β1及IL-6是与DN发生发展最为密切的炎症因子,在疾病过程中它们即有各自独立的作用也相互交联共同加速了DN进程。MCP-1在绝大多数细胞包括系膜细胞和单核细胞中表达,对单核及巨噬细胞具有很强的趋化活性。既往研究证明,无论在糖尿病肾病动物模型,亦或糖尿病肾病患者的尿液及血液中,MCP-1的表达水平均是明显增高的,高水平的MCP-1能够诱导炎症细胞在肾脏组织的浸润来引起肾功能的损害。TGF-β1是DN中另一个重要的细胞因子,既往认为对糖尿病肾小球硬化的过程有极为关键的作用,TGF-β1具有促进硬化的重要特征,诱导细胞肥大和凋亡。体外研究也证实,TGF-β1能够增加肾小球系膜细胞和小管上皮细胞胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白的合成,同时还可抑制胶原酶的合成,刺激金属蛋白抑制剂产生,使细胞外基质降解减少,加剧基质积聚；然而除了致纤维化以外,同时也具有调节免疫和炎症反应的功能,在肾脏,TGF-β1能够上调MCP-1和IL-8等炎症因子的表达,促进肾脏炎症反应的发生。研究表明,糖尿病患者肾小球损害的严重程度与肾小球系膜细胞和足细胞中IL-6mRNA的表达程度相关,提示IL-6可能对这些细胞外基质分泌有促进作用。此外,近期许多研究发现2型糖尿病患者肾小球基底膜增厚程度与IL-6的水平有着密切的关系,而肾小球基底膜增厚被认为是评判糖尿病肾病发生发展过程中强有力的指标。因此可以认为IL-6对DN的发展也有预测作用。核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)蛋白家族是一种多效性的转录因子,是系膜细胞表达多种免疫炎症相关基因的调控枢纽,与系膜细胞增殖和分泌炎症因子密切相关。NF-κB一般以同源或异源二聚体形式存在,在静息状态下以非共价键的形式与IκB形成复合体散在于胞浆中,受到多种因素刺激后,通过IκBs降解从而活化NF-κB,复合体解聚而转移至细胞核内,继而介导下游一系列反应。NF-κB能够促进多种细胞粘附分子和细胞因子mRNA合成,在基因早期应答中发挥着关键性作用。研究显示,NF-κB介导了牵张刺激及高糖诱导的系膜细胞MCP-1产生,同时还参与调节细胞内TGF-β1信号通路。这些初步证据显示,NF-κB极有可能通过调控炎症反应来参与糖尿病肾小球损伤的发病,同时,能够抑制NF-κB通路激活以达到抗炎作用的药物将得到广泛的开发。目前,干预糖尿病肾病进展的方法除了严格的血糖控制、低蛋白饮食、血压控制(特别是ACEI和/或ARB药物物的使用)外,改善细胞内高凝状态也是重要的治疗方案。基于此目的,前列腺素E1(PGE1)等抗血小板药物或抗凝药得到了广泛的应用。李鹏飞等应用PGE1治疗不同分期的DN患者并随访1年发现,短期应用PGE1能够迅速降低各期患者的尿白蛋白水平,甚至是Ⅳ期和Ⅴ期的DN患者尿白蛋白也出现了不同程度的降低。在此之外,还有研究发现PGE1在降低DN患者尿蛋白排泄率的同时,血循环中炎症因子CRP、ICAM-1等均有所降低,提示PGE1在改善血流动力学及改善微循环之外,可能有一定改善炎症反应的作用,但是这一作用是否与改善微循环引起全身炎症状态的改变有关,或是PGE1对肾脏局部也有作用,在这些研究中并未探讨。于是随后大量的体外实验开始研究PGE1在肾脏局部的作用。Dell等运用PGE1处理大鼠系膜细胞后发现,低剂量的PGE1能够抑制环孢素A诱导的大鼠系膜细胞PAI-1的表达。随后他在体外实验中又发现PGE1能降低环孢素A诱导的大鼠系膜细胞TGF-β1mRNA的表达,而M.Kishida等观察到PGE1能抑制TNF-α诱导的人系膜细胞表达PAI-1,提示PGE1在糖尿病肾病引起的肾小球硬化症中有治疗意义。至此,PGE1能够改善肾脏纤维化越来越明确,但是否对肾脏局部炎症因子表达有作用有待进一步研究。因此,本研究旨在探讨PGE1对高糖联合TNF-α诱导的大鼠肾小球系膜细胞株(HBZY-1)损伤的保护作用,并探讨其可能的机制。选取HBZY-1细胞株作为研究对象,观察高糖联合TNF-α对细胞增殖的影响,并同时从蛋白和基因水平上观察炎症因子包括MCP-1、TGF-β1和IL-6表达水平；而加用不同浓度的PGE1处理后,是否能够抑制细胞增殖和上述炎症因子的表达；同时将进一步探讨以上抑制作用产生的可能机制,以期为临床上PGE1治疗糖尿病肾病提供依据。具体研究内容分为以下两个部分：第一章PGE1改善高糖联合TNF-α损伤大鼠肾小球系膜细胞[目的]观察PGE1对高糖联合TNF-α诱导的大鼠肾小球系膜细胞损伤的保护作用。[方法]1、实验对象：选取大鼠肾小球系膜细胞株(HBZY-1)作为研究对象,用含10%胎牛血清的DMEM(正糖)完全培养基进行培养,置于37℃、5%CO2的培养箱内体外培养,每3天传代一次。2、实验分组：根据实验设计分为以下处理组：NG组：正糖(5.6mmol/L)对照组；HT组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)处理组;HTP1组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)+PGE1(0.01ng/mL)处理组；HTP2组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)+PGE1(0.05ng/mL)处理组;HTP3组：高糖(30mmol/L)+TNF-α(10ng/mL)+PGE1(O.lng/mL)处理组；HTP4组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)+PGE1(0.5ng/mL)处理组;HTP5组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)+PGE1(1ng/mL)处理组。各组在正式干预HBZY-1细胞前均先用含0.5%胎牛血清的DMEM(正糖)完全培养基饥饿24h,使细胞同步化于静止期。3、实验方法：四甲基偶氮盐渗入法(MTT法)：测定各组]HBZY-1细胞光密度值(optical density, OD),评价细胞增殖水平。酶联免疫吸附法(ELISA法)：测定HBZY-1细胞培养上清液中MCP-1、TGF-β1及IL-6蛋白浓度；实时荧光定量PCR法(qRT-PCR法)：测定HBZY-1细胞MCP-1、TGF-β1及IL-6mRNA表达情况；4、统计方法：采用SPSS13.0统计软件进行处理,数据采用均数±标准差(x±s)表示,各组均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),任意两组间比较当满足方差齐性时采用LSD法(Least-significant difference test),方差不齐时采用Dunnett’s T3法。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1、PGE1对高糖联合TNF-α诱导HBZY-1细胞增殖的影响：与正糖组相比,在培养至48h以内高糖联合TNF-α均能明显促进HBZY-1细胞的增殖(0.704±0.096vs.0.840±0.040;0.789±0.104vs.1.122±0.136),差异具有统计学意义(P=0.004：P=0.001)。与高糖组相比,在作用24h时,低浓度的PGE1(0.01、0.05及0.1ng/mL)对细胞增殖抑制作用不明显,差异不具统计学意义(P>0.05);而较高浓度的PGE1(0.5及1ng/mL)能够显著降低细胞OD值(0.708±0.095vs.0.840±0.040;0.687±0.082vs.0.840±0.040),差异具有统计学意义(P=0.005；P=0.002)；随着培养时间延长至48h,除HTPl组外,其余药物浓度组较高糖组细胞OD值均明显下降(0.862±0.239vs.1.122±0.136;0.800±0.211vs.1.122±0.136;0.720±0.146vs.1.122±0.136;0.678±0.137vs.1.122±0.136),差异具有统计学意义(P=0.10; P=0.002; P=0.000; P=0.000)。2、PGE1对高糖联合TNF-a诱导的HBZY-1细胞培养上清液中MCP-1、TGF-β1、 IL-6蛋白含量的影响：2.1、各组MCP-1蛋白浓度的比较：与NG组相比,处理的48h以内HT组HBZY-1培养上清液中的MCP-1蛋白浓度均显著增加(51.639±6.699vs.79.932±17.543,82.159±5.389vs.151.353±12.229),差异具有统计学意义(P=0.030；P=0.000)。与HT组相比,24h时药物处理组与HT组相比未出现显著性差异(P>0.05);培养时间延长至48h时,较高浓度的PGE1(0.5、1ng/mL)可明显降低MCP-1蛋白浓度(117.171±25.589vs.151.353±12.229;114.302±14.611vs.151.353±12.229),差异具有统计学意义(P=0.014；P=0.009)；而较低浓度的PGE1(0.05、0.lng/mL)作用不明显,差异没有统计学意义(P>0.05)。2.2、各组TGF-β1蛋白浓度的比较：与NG组相比,24h时HT组细胞上清液中TGF-β1蛋白浓度变化不明显,统计学未见明显差异(P>0.05),48h时,HT组细胞上清液中的TGF-β1蛋白浓度显著增加(644.939±97.461vs.947.349±144.847),差异具有统计学意义(P=0.004)；与HT组相比,24h时各PGE1处理组细胞上清液中的TGF-β1蛋白浓度无明显下降,差异不具有统计学意义(P>0.05)；48h时,较高浓度的PGE1(0.5、 lng/mL)可明显降低TGF-β1蛋白浓度(709.691±130.684vs.947.349±144.847;615.691±75.904vs.947.349±144.847),差异具有统计学意义(P=0.017;P=0.002),而较低浓度的PGE1(0.05、0.1ng/mL)组的抑制作用不明显,差异不具有统计学意义(P>0.05)。2.3、各组IL-6蛋白浓度的比较：试剂盒检测结果显示,各组OD值均低于最低浓度标准品(0.312pg/ml)的OD值,认为在培养48h内上清液中未检测到IL-6。3、PGE1对高糖联合TNF-α诱导HBZY-1细胞MCP-1、TGF-β1、IL-6mRNA表达的影响：3.1各组MCP-1mRNA表达水平的比较：与NG组相比,HT组MCP-1mRNA的表达显著增加(0.240±0.056vs.1.000±0.207),差异具有统计学意义(P=0.000)；与HT组相比,较低浓度的PGE1(0.05,0.1ng/mL)的抑制作用不明显,差异不具有统计学意义(P>0.05),较高浓度的PGE1(0.5、1ng/mL)可明显抑制MCP-1mRNA的表达(0.736±0.073vs.1.000±0.207,0.656±0.107vs.1.000±0.207),差异具有统计学意义(P=0.049;P=0.015)。3.2、各组TGF-β1mRNA表达水平的比较：与NG组相比,HT组TGF-β1mRNA的表达明显增加(0.429±0.150vs.1.000±0.202),差异具有统计学意义(P=0.002)；与HT组相比,较低浓度的PGE1(0.05,0.1ng/mL)的抑制作用不明显,差异不具有统计学意义(P>0.05),较高浓度的PGE1(0.5及lng/mL)可明显抑制TGF-β1mRNA的表达(0.702±0.095vs.1.000±0.202;0.671±0.113vs.1.000±0.202),差异具有统计学意义(P=0.039；P=0.025)。3.3、各组IL-6mRNA表达水平的比较：与NG组相比,HT组IL-6mRNA的表达明显增加(0.436±0.044vs.1.000±0.221),差异具有统计学意义(P=0.001)；与HT组相比,低浓度的PGE1(0.05,0.1,0.5ng/mL)的抑制作用不明显,差异不具有统计学意义(P>0.05),高浓度的PGE1(lng/mL)可明显抑制IL-6mRNA的表达(0.701±0.027vs.1.000±0.221),差异具有统计学意义(P=0.023)。[结论]1、体外模拟高糖联合TNF-α环境下,48h内大鼠系膜细胞均出现明显的增殖,且随着时间延长增殖越来越明显：而一定浓度的PGE1能抑制其增殖。2、高糖联合TNF-α环境能诱导大鼠系膜细胞细胞分泌MCP-1以及TGF-β1蛋白,较高浓度的PGE1能抑制大鼠系膜细胞MCP-1以及TGF-β1蛋白的分泌。3、高糖联合TNF-α环境能诱导大鼠系膜细胞细胞MCP-1、 TGF-β1以及IL-6mRNA分泌,较高浓度的PGE1能抑制大鼠系膜细胞MCP-1、TGF-β1以及IL-6mRNA的表达。第二章PGE1改善高糖联合TNF-a损伤大鼠肾小球系膜细胞的机制[目的]探讨PGE1改善高糖联合TNF-α诱导大鼠肾小球系膜细胞损伤的潜在机制。[方法]1、实验对象：选取大鼠肾小球系膜细胞细胞株(HBZY-1)作为研究对象,采用含10%胎牛血清的DMEM(正糖)完全培养基进行培养,置于37℃、5%CO2的培养箱内体外培养,每3天传代一次。2、实验分组：根据实验设计分为以下处理组：NG组：正糖(5.6mmol/L)对照组；HT组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)处理组;HTP5组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)+PGE1(1ng/mL)处理组。各组在正式干预细胞前均采用含0.5%胎牛血清的DMEM(正糖)完全培养基饥饿24h,使细胞同步于静止期。4、实验方法：细胞免疫荧光法：检测细胞内NF-κB p65核转位情况。[结果]与NG对照组相比,高糖联合TNF-α诱导的细胞核NF-κB p65荧光强度明显增强；与HT组相比,HTP5组的细胞核内NF-κB p65荧光强度明显减弱。[结论]高糖联合TNF-α可诱导HBZY-1细胞内NF-κB p65核转位；PGE1能够抑制高糖联合TNF-α诱导的HBZY-1细胞的NF-κB p65核转位,提示NF-κB通路可能是PGE1改善高糖联合TNF-α诱导的HBZY-1细胞损伤的机制。