由于实验技术和科学研究的不断发展，作为一种表观遗传机制，DNA甲基化开始越来越多地在生物研究中出现。肿瘤发生与CpG岛甲基化相关。CpG岛是指在基因组中存在的一些CpG序列密度很高的区域，是富集鸟嘌呤和胞嘧啶的区域。慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一种较为常见的恶性血液病，可以分为慢性期（chronic phase，CP）、加速期（accelerated phase，AP）和急变期（blastic phase， BP）。CML-CP自然病程仅为大约3-5年，未经治疗的CML-CP可以很快发展为CML-AP和CML-BP。大量研究表明，在CML急性进展期有多种基因表达结构和活性的异常。　　SHP-1基因作为一种受体酪氨酸磷酸酶，也可以在细胞信号传导中充当非常关键的负调控因子的角色。经研究发现SHP-l基因在各种白血病、恶性淋巴瘤细胞株和一些肿瘤性疾病中表达量变少或消失。其原因可能是由于SHP-1基因启动子区处于高甲基化状态所致。故推测，SHP-1基因甲基化在恶性血液系统疾病发病中起着重要的作用。　　DNMT1(DNA methytransferase，DNMT1)、EZH2(enhancer ofzeste homolog2，EZH2)分别作为DNA甲基转移酶及PcG（Polycomb Group）蛋白家族成员，在多种基因甲基化过程中均起到了重要作用。　　DNA甲基化修饰作为表观遗传修饰的一个重要手段，DNA甲基转移酶起着重要作用。DNA甲基化需要 DNA甲基转移酶的参与。而 EZH2属于 PcG基因家族的重要成员之一，已有研究发现，其在血液系统疾病中存在并发挥着重要作用。EZH2可以催化组蛋白H3氨基末端的第27位赖氨酸发生三甲基化，从而抑制靶基因表达，进一步触发或保持染色体的转录抑制状态。这些靶基因大都具有抑制肿瘤发病以及调控干细胞分化的效力，它们的沉默终将导致肿瘤的发生和干细胞多向分化的障碍。　　酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼(Imatinib，IM)为治疗慢性粒细胞白血病(CML)的主要药物，但仍有部分CML患者会出现耐药等情况。目前，在关于慢性粒细胞白血病急变机制的研究中，DNMT1及EZH2与SHP-1基因甲基化的关系，国内外研究罕见。故为进一步改善CML的治疗效果，最大限度地延长患者的生存期，本文通过研究DNMT1及EZH2与SHP-1基因表观沉默的关系，进一步探讨CML进展的机制，为CML的治疗开拓新的思路。本研究分为以下三部分：　　第一部分：SHP-1、DNMT1及EZH2基因在慢性髓系白血病中的表达　　目的：通过检测DNMT1、EZH2、SHP-1基因在CML患者及K562细胞株中的表达及 SHP-1基因在 CML不同时期的甲基化状态，探讨DNMT1及EZH2与SHP-1甲基化的关系。　　方法：选取2014年3月至2015年6月河北大学附属医院血液科慢性髓系白血病患者骨髓及外周血标本60例，健康志愿者外周血标本l0例及K562细胞株。分为CML-CP组，共33例患者；CML-AP组，共10例患者；CML-BP组，共17例患者。通过SYBR Green荧光定量PCR及Western Blot检测骨髓或外周血单个核细胞中DNMT1、EZH2、SHP-1基因的表达情况，并通过甲基化特异性PCR（MSP）检测SHP-1基因的甲基化状态。用SAS9.1.3(美国SAS Institute Inc.公司)软件进行统计学分析。P<0.05为有统计学意义。　　结果：　　1.CML患者SHP-1mRNA的表达　　通过SYBR Green荧光定量PCR检测发现，对照组(NC)、CML-CP、CML-AP、CML-BP组SHP-1mRNA的相对表达情况是：1.49土0.71、1.36土0.65、0.41土0.28、0.28土0.12。NC及CML-CP患者SHP-l mRNA表达水平较CML-AP及CML-BP高，且有统计学差异，P<0.05。CML-AP与CML-BP患者SHP-l mRNA表达水平无明显差别，P>0.05。SHP-1mRNA表达水平CML-CP组较NC组无统计学差异，P>0.05。　　2. CML患者SHP-1蛋白表达水平　　通过Western blot方法检测CML患者中SHP-1蛋白的水平，分别选取CML-CP、CML-BP及CML-AP患者共10例。结果表明SHP-1蛋白在CML-CP患者表达水平最高，CML-AP及CML-BP患者较CML-CP表达水平下降，有统计学差异，P<0.05。SHP-1蛋白的表达水平在 CML-AP与CML-BP的患者无明显差别，P>0.05。SHP-1蛋白在CML-CP患者组及NC组中表达亦无明显差异，P>0.05。　　3.在临床急变期病例中，SHP-1存在高度甲基化。　　33例CML-CP患者中7例检测到SHP-l基因启动子区的甲基化，甲基化发生率为21.2％；而在CML加速期及急变期患者，都检测到了甲基化。SHP-1基因甲基化发生率在CML进展期较CML-CP组明显增高，有统计学差异， P<0.01。其中，CML-AP完全甲基化4例（4/10），占40%， CML-BP完全甲基化8例（8/17),占47%，CML-BP组完全甲基化程度略高，但无统计学意义，P>0.05。　　4. DNMT1在慢性粒细胞白血病患者中的表达　　荧光定量PCR结果显示，健康正常对照组(NC)、CML-CP、CML-AP、CML-BP组的 DNMT1的相对表达水平分别为1.31±0.18、1.75±0.53、2.76±0.78、3.05±1.23。CML疾病进展期较CML-CP及NC组表达水平增高， P<0.05；CML-CP患者较NC组表达水平无变化，P>0.05。CML-AP与CML-BP相比表达水平无差异，P>0.05。　　5. EZH2在慢性粒细胞白血病患者中的表达　　荧光定量PCR结果显示，健康正常对照组(NC)、CML-CP、CML-AP、CML-BP组骨髓或外周血单个核细胞的 EZH2相对表达水平分别为1.12±0.08、1.25±0.33、1.99±0.78、2.15±1.01。CML疾病进展期较CML-CP及NC组表达水平增高， P<0.05；CML-CP患者较NC组表达水平无变化，P>0.05。CML-AP与CML-BP相比表达水平无差异，P>0.05。　　6. CML患者DNMT1、EZH2与SHP-1基因mRNA表达的相关性　　SHP-1在NC及CML-CP患者表达明显增高，而在CML-AP、CML-BP患者中逐渐下降；DNMT1、EZH2与SHP-1表达趋势恰好相反，二者在NC及CML-CP患者中表达较低，相反，在CML-AP及CML-BP患者中表达明显增高。DNMT1与SHP-1表达趋势呈负相关，P<0.05，EZH2与SHP-1表达趋势呈负相关，P<0.05。　　第二部分：DNMT1及EZH2抑制剂对K562细胞株凋亡影响的研究　　目的：通过细胞培养、流式细胞学检测等手段研究 DNMT及 EZH2抑制剂对K562细胞株凋亡的影响及其与SHP-1甲基化状态的关系。探讨DNMT及EZH2抑制剂在CML的治疗中的意义。　　方法：培养K562细胞株，并分别加用地西他滨(5-aza-2’-deoxycytidine,DAC)、IM、DZNep药物干预。应用CCK-8、流式细胞学检测药物对K562细胞株抑制、凋亡及周期的影响；应用QT-PCR方法、Western blot、甲基化特异性PCR方法检测DZNep对K562细胞株中EZH2表达及SHP-1基因甲基化状态的变化。　　结果：　　1. CCK8方法检测K562细胞增殖抑制率和半数抑制浓度（IC50）。　　DAC组及IM组对K562细胞抑制率均随药物浓度增大、随培养时间延长而增高。IM对K562细胞株作用的IC50值为0.25±0.02umol/l（48小时）。IM+DAC两药联合组对细胞株抑制的影响均高于单独用药组。另外，IM0.25umol/l+DAC100umol/l作用后24小时即可使抑制率达到51.06±1.23%，比IM单独用药达半数抑制率时间明显缩短（48小时）。IM0.1umol/l+DAC10umol/l作用后48小时即可使细胞株抑制率达到50.21±1.35%，比单独应用 IM达半数抑制率浓度明显降低（0.25±0.02umol/l）可见DAC对于K562细胞株增殖有抑制作用，DAC与IM两药联合有协同作用，并可以降低IM的IC50值。对DAC用于CML的治疗尤其是急变期的治疗确立了很好的实验学依据。　　2.流式细胞学检测DAC对K562细胞株凋亡的影响　　分别取DAC浓度为50 umol/l,100 umol/l,200umol/l，K562细胞株加用DAC培养48小时，设K562细胞株为对照组，测细胞凋亡情况。DAC浓度为50umol/l时，细胞凋亡率为33.6±1.78%；DAC浓度为100umol/l时，细胞凋亡率为35.71±1.96%；DAC浓度为200umol/l时，细胞凋亡率为46.99±2.02%。对照组凋亡率30.70±1.58%。加药组随 DAC浓度的增加，细胞凋亡率增加，与对照组有统计学差异，P<0.05。　　3.两药联合作用大于单药　　K562细胞株分别加DAC(100umol/l）,IM（0.25umol/l），IM（0.25umol/l）+DAC（100umol/l）培养24小时后，应用流式细胞学检测K562细胞株的凋亡情况。K562细胞株凋亡率24.52±1.36%，单用DAC组30.76±1.61%，单用IM组凋亡率33.45±1.88%，两药联合组凋亡率47.01±2.12%，明显高于不加药组及单药组。差别有统计学意义，P<0.05。　　4.IM对细胞周期的影响　　分别取IM三个浓度（0.05 uM,0.1 uM,0.25uM),作用于K562细胞株48小时后，测定细胞周期。0.05uM IM组G1期40.37±1.68%，G2期6.15±1.01%，S期53.48±2.73%；0.1uM IM组G1期48.89±2.74%，G2期4.74±0.61%，S期46.38±1.53%；0.25uM IM组G1期80.88±3.04%，G2期0.17±0.05%，S期18.41±1.73%；对照组G1期34.76±2.67%，G2期7.51±1.65%，S期57.72±3.68%。故IM作用下，G1升高，G2、S期下降，并于剂量呈正相关。　　5.DAC对细胞周期的影响相似，并与剂量呈正相关　　分别取DAC两个浓度（100uM,200uM),作用于K562细胞株48小时后，测定细胞周期。100 uM DAC组G1期42.81±3.07%，G2期5.83±0.77%， S期51.37±2.51%；200uM DAC组G1期62.90±2.96%，G2期1.22±0.27%， S期35.88±2.36%；对照组G1期34.76±2.67%，G2期7.51±1.65%，S期57.72±3.68%；故DAC作用下，G1期升高，G2、S期下降，并于剂量呈正相关。与IM作用相似。　　6.加用DZNep后对K562细胞株凋亡的影响　　对K562细胞株加用DZNep（浓度10uM）进行药物干预，于培养0小时、48小时、72小时应用应用QT-PCR方法、Western blot方法检测EZH2的表达。另外，分别应用甲基化特异性PCR方法检测加药组及未加药组K562细胞株的SHP-1基因的甲基化状态。　　QT-PCR结果显示，K562组EZH2相对表达水平为2.50±1.18，加用DZNep培养48小时后EZH2相对表达水平降至2.07±1.09，培养72小时后降至1.70±0.68，有明显下降趋势。另外，加药后EZH2蛋白水平表达明显降低，随着培养时间的延长，EZH2表达下降越明显。K562细胞株SHP-1基因存在高甲基化状态，而加用DZNep后，其甲基化状态减弱。　　第三部分：探讨 EZH2和 DNMT1在慢性粒细胞白血病（CML）进展期与SHP-1基因启动子区的关系　　目的：通过细胞培养、染色质免疫沉淀（ChIP）、QT-PCR方法、Western blot、甲基化特异性PCR方法，进一步深入研究DNMT1、EZH2与SHP-1基因启动子区的联系，探讨二者在SHP-1基因甲基化过程中所起的作用，从而为CML进展期的治疗探索新的思路。　　方法：分别取DAC、DZNep作用于K562细胞株，检测加药前后DNMT1、EZH2、SHP-1的表达及SHP-1基因甲基化状态；应用ChIP方法检测加用DAC前后K562细胞株中SHP-1基因甲基化启动子区与DNMT1的联系强度，并检测加用DZNep前后K562细胞株中SHP-1基因甲基化启动子区与EZH2的联系强度。　　结果：　　1.K562细胞株加用DAC后，DNMT1表达减弱，SHP-1表达增加，二者表达呈负相关，且加药组SHP-1甲基化程度减弱　　QT-PCR方法检测DNMT1在K562细胞株中的表达水平为3.54±1.23， SHP-1表达水平为0.18土0.08，加用DAC72小时后，DNMT1表达水平降至1.55±0.61，SHP-1表达水平升至1.08土0.20，且DNMT1及SHP-1在用药前后的表达差别有统计学意义，P<0.05。Western Blot方法检测，用药后SHP-1蛋白表达增加，DNMT1蛋白表达减低。K562细胞株中检测到SHP-1为完全甲基化状态，DAC加药干预后SHP-1为部分甲基化状态。　　2.K562细胞株加用DZNep后，EZH2表达减低，SHP-1表达增加，二者表达呈负相关，且加药组SHP-1甲基化程度减弱　　QT-PCR方法检测EZH2在K562细胞株中的表达水平为2.54±1.20， SHP-1表达水平为0.18土0.08，加用DZNep72小时后，EZH2表达水平降至1.80±0.62，SHP-1表达水平升至0.75土0.18，且EZH2及SHP-1在用药前后的表达差别有统计学意义，P<0.05。Western Blot方法检测，用药后SHP-1蛋白表达增加，EZH2蛋白表达减低。K562细胞株中检测到SHP-1为完全甲基化状态，加DZNep干预后SHP-1为部分甲基化状态。　　3.ChIP检测DNMT1与K562细胞SHP-1基因启动子区结合，加用DAC后，启动子区结合的DNMT1减低　　通过加用DNMT1抗体对K562细胞株进行ChIP检测，发现DNMT1广泛聚集于SHP-1基因启动子区。加用DAC对K562细胞进行药物干预，并通过ChIP检测，结果显示药物处理后的K562细胞株中，结合于SHP-1基因启动子区的 DNMT1减低。并且加药处理后的 K562细胞株 SHP-1的表达增高，SHP-1甲基化程度减低。　　4.ChIP检测EZH2与K562细胞SHP-1基因启动子区结合，加用DZNep后，启动子区结合的EZH2减低　　通过加用EZH2抗体对K562细胞株进行ChIP检测，发现EZH2广泛聚集于SHP-1基因启动子区。加用DZNep对K562细胞进行药物干预，并通过ChIP检测，结果显示药物处理后的K562细胞株中，结合于SHP-1基因启动子区的EZH2减低。并且加药处理后的K562细胞株 SHP-1的表达增高，SHP-1甲基化程度减低。　　结论:　　1.慢性髓系白血病患者骨髓或外周血单个核细胞中SHP-1mRNA及蛋白表达水平CML-AP及CML-BP患者较CML-CP患者明显降低。DNMT1及EZH2mRNA表达水平CML-AP及CML-BP患者较CML-CP患者明显升高。DNMT1及EZH2mRNA在CML各期中的表达趋势均与SHP-1的表达趋势相反。　　2.通过MSP检测发现，NC组无SHP-1启动子的甲基化，而CML-AP及CML-BP患者SHP-1启动子的甲基化率明显高于CML-CP。提示SHP-1启动子的甲基化可能引起SHP-1基因表达水平降低，而且DNMT1及EZH2可能共同参与了SHP-1基因甲基化过程，与慢性髓系白血病疾病进展密切相关。　　3.DAC对于K562细胞株有促凋亡作用，DAC与IM两药联合对细胞凋亡有协同作用，并可以降低IM的IC50值。DAC及IM作用下的K562细胞株G1升高，G2、S期下降，并与剂量呈正相关。DAC及IM两药联合对细胞凋亡作用强于单药。　　4.K562细胞株加用DZNep后EZH2在分子水平及蛋白水平表达均降低，SHP-1蛋白及基因水平表达增加，SHP-1基因甲基化状态减弱。K562细胞株加用DAC培养后，DNMT1基因及蛋白水平表达降低，SHP-1蛋白及基因水平表达增加，SHP-1甲基化程度减弱。　　5.DNMT1、EZH2均结合于SHP-1基因的启动子区，参与SHP-1基因甲基化，与CML疾病进展相关。