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由于实验技术和科学研究的不断发展,作为一种表观遗传机制,DNA甲基化开始越来越多地在生物研究中出现。肿瘤发生与CpG岛甲基化相关。CpG岛是指在基因组中存在的一些CpG序列密度很高的区域,是富集鸟嘌呤和胞嘧啶的区域。慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是一种较为常见的恶性血液病,可以分为慢性期(chronic phase,CP)、加速期(accelerated phase,AP)和急变期(blastic phase, BP)。CML-CP自然病程仅为大约3-5年,未经治疗的CML-CP可以很快发展为CML-AP和CML-BP。大量研究表明,在CML急性进展期有多种基因表达结构和活性的异常。 SHP-1基因作为一种受体酪氨酸磷酸酶,也可以在细胞信号传导中充当非常关键的负调控因子的角色。经研究发现SHP-l基因在各种白血病、恶性淋巴瘤细胞株和一些肿瘤性疾病中表达量变少或消失。其原因可能是由于SHP-1基因启动子区处于高甲基化状态所致。故推测,SHP-1基因甲基化在恶性血液系统疾病发病中起着重要的作用。 DNMT1(DNA methytransferase,DNMT1)、EZH2(enhancer ofzeste homolog2,EZH2)分别作为DNA甲基转移酶及PcG(Polycomb Group)蛋白家族成员,在多种基因甲基化过程中均起到了重要作用。 DNA甲基化修饰作为表观遗传修饰的一个重要手段,DNA甲基转移酶起着重要作用。DNA甲基化需要 DNA甲基转移酶的参与。而 EZH2属于 PcG基因家族的重要成员之一,已有研究发现,其在血液系统疾病中存在并发挥着重要作用。EZH2可以催化组蛋白H3氨基末端的第27位赖氨酸发生三甲基化,从而抑制靶基因表达,进一步触发或保持染色体的转录抑制状态。这些靶基因大都具有抑制肿瘤发病以及调控干细胞分化的效力,它们的沉默终将导致肿瘤的发生和干细胞多向分化的障碍。 酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼(Imatinib,IM)为治疗慢性粒细胞白血病(CML)的主要药物,但仍有部分CML患者会出现耐药等情况。目前,在关于慢性粒细胞白血病急变机制的研究中,DNMT1及EZH2与SHP-1基因甲基化的关系,国内外研究罕见。故为进一步改善CML的治疗效果,最大限度地延长患者的生存期,本文通过研究DNMT1及EZH2与SHP-1基因表观沉默的关系,进一步探讨CML进展的机制,为CML的治疗开拓新的思路。本研究分为以下三部分: 第一部分:SHP-1、DNMT1及EZH2基因在慢性髓系白血病中的表达 目的:通过检测DNMT1、EZH2、SHP-1基因在CML患者及K562细胞株中的表达及 SHP-1基因在 CML不同时期的甲基化状态,探讨DNMT1及EZH2与SHP-1甲基化的关系。 方法:选取2014年3月至2015年6月河北大学附属医院血液科慢性髓系白血病患者骨髓及外周血标本60例,健康志愿者外周血标本l0例及K562细胞株。分为CML-CP组,共33例患者;CML-AP组,共10例患者;CML-BP组,共17例患者。通过SYBR Green荧光定量PCR及Western Blot检测骨髓或外周血单个核细胞中DNMT1、EZH2、SHP-1基因的表达情况,并通过甲基化特异性PCR(MSP)检测SHP-1基因的甲基化状态。用SAS9.1.3(美国SAS Institute Inc.公司)软件进行统计学分析。P<0.05为有统计学意义。 结果: 1.CML患者SHP-1mRNA的表达 通过SYBR Green荧光定量PCR检测发现,对照组(NC)、CML-CP、CML-AP、CML-BP组SHP-1mRNA的相对表达情况是:1.49土0.71、1.36土0.65、0.41土0.28、0.28土0.12。NC及CML-CP患者SHP-l mRNA表达水平较CML-AP及CML-BP高,且有统计学差异,P<0.05。CML-AP与CML-BP患者SHP-l mRNA表达水平无明显差别,P>0.05。SHP-1mRNA表达水平CML-CP组较NC组无统计学差异,P>0.05。 2. CML患者SHP-1蛋白表达水平 通过Western blot方法检测CML患者中SHP-1蛋白的水平,分别选取CML-CP、CML-BP及CML-AP患者共10例。结果表明SHP-1蛋白在CML-CP患者表达水平最高,CML-AP及CML-BP患者较CML-CP表达水平下降,有统计学差异,P<0.05。SHP-1蛋白的表达水平在 CML-AP与CML-BP的患者无明显差别,P>0.05。SHP-1蛋白在CML-CP患者组及NC组中表达亦无明显差异,P>0.05。 3.在临床急变期病例中,SHP-1存在高度甲基化。 33例CML-CP患者中7例检测到SHP-l基因启动子区的甲基化,甲基化发生率为21.2%;而在CML加速期及急变期患者,都检测到了甲基化。SHP-1基因甲基化发生率在CML进展期较CML-CP组明显增高,有统计学差异, P<0.01。其中,CML-AP完全甲基化4例(4/10),占40%, CML-BP完全甲基化8例(8/17),占47%,CML-BP组完全甲基化程度略高,但无统计学意义,P>0.05。 4. DNMT1在慢性粒细胞白血病患者中的表达 荧光定量PCR结果显示,健康正常对照组(NC)、CML-CP、CML-AP、CML-BP组的 DNMT1的相对表达水平分别为1.31±0.18、1.75±0.53、2.76±0.78、3.05±1.23。CML疾病进展期较CML-CP及NC组表达水平增高, P<0.05;CML-CP患者较NC组表达水平无变化,P>0.05。CML-AP与CML-BP相比表达水平无差异,P>0.05。 5. EZH2在慢性粒细胞白血病患者中的表达 荧光定量PCR结果显示,健康正常对照组(NC)、CML-CP、CML-AP、CML-BP组骨髓或外周血单个核细胞的 EZH2相对表达水平分别为1.12±0.08、1.25±0.33、1.99±0.78、2.15±1.01。CML疾病进展期较CML-CP及NC组表达水平增高, P<0.05;CML-CP患者较NC组表达水平无变化,P>0.05。CML-AP与CML-BP相比表达水平无差异,P>0.05。 6. CML患者DNMT1、EZH2与SHP-1基因mRNA表达的相关性 SHP-1在NC及CML-CP患者表达明显增高,而在CML-AP、CML-BP患者中逐渐下降;DNMT1、EZH2与SHP-1表达趋势恰好相反,二者在NC及CML-CP患者中表达较低,相反,在CML-AP及CML-BP患者中表达明显增高。DNMT1与SHP-1表达趋势呈负相关,P<0.05,EZH2与SHP-1表达趋势呈负相关,P<0.05。 第二部分:DNMT1及EZH2抑制剂对K562细胞株凋亡影响的研究 目的:通过细胞培养、流式细胞学检测等手段研究 DNMT及 EZH2抑制剂对K562细胞株凋亡的影响及其与SHP-1甲基化状态的关系。探讨DNMT及EZH2抑制剂在CML的治疗中的意义。 方法:培养K562细胞株,并分别加用地西他滨(5-aza-2’-deoxycytidine,DAC)、IM、DZNep药物干预。应用CCK-8、流式细胞学检测药物对K562细胞株抑制、凋亡及周期的影响;应用QT-PCR方法、Western blot、甲基化特异性PCR方法检测DZNep对K562细胞株中EZH2表达及SHP-1基因甲基化状态的变化。 结果: 1. CCK8方法检测K562细胞增殖抑制率和半数抑制浓度(IC50)。 DAC组及IM组对K562细胞抑制率均随药物浓度增大、随培养时间延长而增高。IM对K562细胞株作用的IC50值为0.25±0.02umol/l(48小时)。IM+DAC两药联合组对细胞株抑制的影响均高于单独用药组。另外,IM0.25umol/l+DAC100umol/l作用后24小时即可使抑制率达到51.06±1.23%,比IM单独用药达半数抑制率时间明显缩短(48小时)。IM0.1umol/l+DAC10umol/l作用后48小时即可使细胞株抑制率达到50.21±1.35%,比单独应用 IM达半数抑制率浓度明显降低(0.25±0.02umol/l)可见DAC对于K562细胞株增殖有抑制作用,DAC与IM两药联合有协同作用,并可以降低IM的IC50值。对DAC用于CML的治疗尤其是急变期的治疗确立了很好的实验学依据。 2.流式细胞学检测DAC对K562细胞株凋亡的影响 分别取DAC浓度为50 umol/l,100 umol/l,200umol/l,K562细胞株加用DAC培养48小时,设K562细胞株为对照组,测细胞凋亡情况。DAC浓度为50umol/l时,细胞凋亡率为33.6±1.78%;DAC浓度为100umol/l时,细胞凋亡率为35.71±1.96%;DAC浓度为200umol/l时,细胞凋亡率为46.99±2.02%。对照组凋亡率30.70±1.58%。加药组随 DAC浓度的增加,细胞凋亡率增加,与对照组有统计学差异,P<0.05。 3.两药联合作用大于单药 K562细胞株分别加DAC(100umol/l),IM(0.25umol/l),IM(0.25umol/l)+DAC(100umol/l)培养24小时后,应用流式细胞学检测K562细胞株的凋亡情况。K562细胞株凋亡率24.52±1.36%,单用DAC组30.76±1.61%,单用IM组凋亡率33.45±1.88%,两药联合组凋亡率47.01±2.12%,明显高于不加药组及单药组。差别有统计学意义,P<0.05。 4.IM对细胞周期的影响 分别取IM三个浓度(0.05 uM,0.1 uM,0.25uM),作用于K562细胞株48小时后,测定细胞周期。0.05uM IM组G1期40.37±1.68%,G2期6.15±1.01%,S期53.48±2.73%;0.1uM IM组G1期48.89±2.74%,G2期4.74±0.61%,S期46.38±1.53%;0.25uM IM组G1期80.88±3.04%,G2期0.17±0.05%,S期18.41±1.73%;对照组G1期34.76±2.67%,G2期7.51±1.65%,S期57.72±3.68%。故IM作用下,G1升高,G2、S期下降,并于剂量呈正相关。 5.DAC对细胞周期的影响相似,并与剂量呈正相关 分别取DAC两个浓度(100uM,200uM),作用于K562细胞株48小时后,测定细胞周期。100 uM DAC组G1期42.81±3.07%,G2期5.83±0.77%, S期51.37±2.51%;200uM DAC组G1期62.90±2.96%,G2期1.22±0.27%, S期35.88±2.36%;对照组G1期34.76±2.67%,G2期7.51±1.65%,S期57.72±3.68%;故DAC作用下,G1期升高,G2、S期下降,并于剂量呈正相关。与IM作用相似。 6.加用DZNep后对K562细胞株凋亡的影响 对K562细胞株加用DZNep(浓度10uM)进行药物干预,于培养0小时、48小时、72小时应用应用QT-PCR方法、Western blot方法检测EZH2的表达。另外,分别应用甲基化特异性PCR方法检测加药组及未加药组K562细胞株的SHP-1基因的甲基化状态。 QT-PCR结果显示,K562组EZH2相对表达水平为2.50±1.18,加用DZNep培养48小时后EZH2相对表达水平降至2.07±1.09,培养72小时后降至1.70±0.68,有明显下降趋势。另外,加药后EZH2蛋白水平表达明显降低,随着培养时间的延长,EZH2表达下降越明显。K562细胞株SHP-1基因存在高甲基化状态,而加用DZNep后,其甲基化状态减弱。 第三部分:探讨 EZH2和 DNMT1在慢性粒细胞白血病(CML)进展期与SHP-1基因启动子区的关系 目的:通过细胞培养、染色质免疫沉淀(ChIP)、QT-PCR方法、Western blot、甲基化特异性PCR方法,进一步深入研究DNMT1、EZH2与SHP-1基因启动子区的联系,探讨二者在SHP-1基因甲基化过程中所起的作用,从而为CML进展期的治疗探索新的思路。 方法:分别取DAC、DZNep作用于K562细胞株,检测加药前后DNMT1、EZH2、SHP-1的表达及SHP-1基因甲基化状态;应用ChIP方法检测加用DAC前后K562细胞株中SHP-1基因甲基化启动子区与DNMT1的联系强度,并检测加用DZNep前后K562细胞株中SHP-1基因甲基化启动子区与EZH2的联系强度。 结果: 1.K562细胞株加用DAC后,DNMT1表达减弱,SHP-1表达增加,二者表达呈负相关,且加药组SHP-1甲基化程度减弱 QT-PCR方法检测DNMT1在K562细胞株中的表达水平为3.54±1.23, SHP-1表达水平为0.18土0.08,加用DAC72小时后,DNMT1表达水平降至1.55±0.61,SHP-1表达水平升至1.08土0.20,且DNMT1及SHP-1在用药前后的表达差别有统计学意义,P<0.05。Western Blot方法检测,用药后SHP-1蛋白表达增加,DNMT1蛋白表达减低。K562细胞株中检测到SHP-1为完全甲基化状态,DAC加药干预后SHP-1为部分甲基化状态。 2.K562细胞株加用DZNep后,EZH2表达减低,SHP-1表达增加,二者表达呈负相关,且加药组SHP-1甲基化程度减弱 QT-PCR方法检测EZH2在K562细胞株中的表达水平为2.54±1.20, SHP-1表达水平为0.18土0.08,加用DZNep72小时后,EZH2表达水平降至1.80±0.62,SHP-1表达水平升至0.75土0.18,且EZH2及SHP-1在用药前后的表达差别有统计学意义,P<0.05。Western Blot方法检测,用药后SHP-1蛋白表达增加,EZH2蛋白表达减低。K562细胞株中检测到SHP-1为完全甲基化状态,加DZNep干预后SHP-1为部分甲基化状态。 3.ChIP检测DNMT1与K562细胞SHP-1基因启动子区结合,加用DAC后,启动子区结合的DNMT1减低 通过加用DNMT1抗体对K562细胞株进行ChIP检测,发现DNMT1广泛聚集于SHP-1基因启动子区。加用DAC对K562细胞进行药物干预,并通过ChIP检测,结果显示药物处理后的K562细胞株中,结合于SHP-1基因启动子区的 DNMT1减低。并且加药处理后的 K562细胞株 SHP-1的表达增高,SHP-1甲基化程度减低。 4.ChIP检测EZH2与K562细胞SHP-1基因启动子区结合,加用DZNep后,启动子区结合的EZH2减低 通过加用EZH2抗体对K562细胞株进行ChIP检测,发现EZH2广泛聚集于SHP-1基因启动子区。加用DZNep对K562细胞进行药物干预,并通过ChIP检测,结果显示药物处理后的K562细胞株中,结合于SHP-1基因启动子区的EZH2减低。并且加药处理后的K562细胞株 SHP-1的表达增高,SHP-1甲基化程度减低。 结论: 1.慢性髓系白血病患者骨髓或外周血单个核细胞中SHP-1mRNA及蛋白表达水平CML-AP及CML-BP患者较CML-CP患者明显降低。DNMT1及EZH2mRNA表达水平CML-AP及CML-BP患者较CML-CP患者明显升高。DNMT1及EZH2mRNA在CML各期中的表达趋势均与SHP-1的表达趋势相反。 2.通过MSP检测发现,NC组无SHP-1启动子的甲基化,而CML-AP及CML-BP患者SHP-1启动子的甲基化率明显高于CML-CP。提示SHP-1启动子的甲基化可能引起SHP-1基因表达水平降低,而且DNMT1及EZH2可能共同参与了SHP-1基因甲基化过程,与慢性髓系白血病疾病进展密切相关。 3.DAC对于K562细胞株有促凋亡作用,DAC与IM两药联合对细胞凋亡有协同作用,并可以降低IM的IC50值。DAC及IM作用下的K562细胞株G1升高,G2、S期下降,并与剂量呈正相关。DAC及IM两药联合对细胞凋亡作用强于单药。 4.K562细胞株加用DZNep后EZH2在分子水平及蛋白水平表达均降低,SHP-1蛋白及基因水平表达增加,SHP-1基因甲基化状态减弱。K562细胞株加用DAC培养后,DNMT1基因及蛋白水平表达降低,SHP-1蛋白及基因水平表达增加,SHP-1甲基化程度减弱。 5.DNMT1、EZH2均结合于SHP-1基因的启动子区,参与SHP-1基因甲基化,与CML疾病进展相关。