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研究背景:在周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)损伤中,轴突再生是神经功能恢复的基本过程。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)在体外能够发挥分化成各种神经细胞,例如神经元和少突胶质细胞等神经胶质细胞。目前,已经广泛利用这些能力来产生用于临床应用的各种神经细胞并且作为治疗神经疾病的潜在手段。在周围神经再生中,施万细胞(schwann cells,SCs)与神经的再生紧密联系,它沿神经元的突起分布,包裹在神经纤维上形成髓鞘。SCs能通过分泌神经营养因子、蛋白等多种活性物质,促进受损的神经元的存活及其轴突再生,参与周围神经系统中神经纤维的构成。在外周神经损伤后,SCs被激活去分化,参与去除髓鞘碎片,为轴突再生提供途径。移植的SCs已经显示出在动物实验中有促进神经再生的作用。然而,SCs的临床治疗效果往往受其来源的诸多限制,我们课题组先前的研究已经获得人胚胎干细胞源神经干细胞(human embryonic stem cell derived-neural stem cells,h ESC-NSCs),理论上人神经干细胞源施万样细胞(schwann-like cells derived from human neural stem cells,以下简称SC-like cells)可从h ESC-NSCs中源源不断诱导分化而来。同时,我们猜测正如传统SCs一样,SC-like cells可以通过分泌各种活性物质促进轴突生长和神经再生。微囊泡(microvesicles,MVs)是源自亲本细胞的微小膜性细胞器结构,其在细胞之间转移细胞质内容物,包括蛋白质,脂质和RNA等物质,可以从细胞条件培养基中分离而获取。这种细胞之间的MVs传递是近年来一种新的细胞间通讯机制。基于我们先前的研究,h ESC-NSCs释放的MVs(h ESC-NSC-MVs)促进大鼠坐骨神经横断性损伤后的功能恢复。因此,人神经干细胞源施万样细胞的微囊泡(microvesicles of schwann-like cells derived from human neural stem cells,以下简称SC-like cell MVs)可能对神经元轴突再生的促进作用及对神经的修复作用会更优于h ESC-NSC-MVs,并对SC-like cell MVs促进轴突生长中可能存在的机制进行初步探究。研究目的:研究SC-like cells的诱导分化,SC-like cell MVs对大鼠坐骨神经5mm横断损伤后的修复作用及对促进神经元轴突生长机制的初步探讨。研究方法:(1)将h ESC-NSCs定向诱导分化为SC-like cells,并利用细胞形态学、免疫荧光染色、RT-q PCR的方法进行鉴定。(2)收集SC-like cells的条件培养基,通过超速离心法提取SC-like cell MVs,并检测SC-like cell MVs表征。(3)建立SD大鼠坐骨神经横断性损伤模型,运用高分辨率X射线成像系统检测损伤模型的可行性,应用坐骨神经功能指数(sciatic nerve functional index,SFI)、HE染色、免疫染色染色等方法评估SC-like cell MVs对坐骨神经损伤后的修复作用。(4)背根神经节原代培养,建立体外神经元模型。(5)将SC-like cell MVs与背根神经节共培养,观察轴突生长情况。(6)将SC-like cell MVs与神经元样N2a细胞系共培养,检测分化情况、突起个数及长度,并用RT-q PCR检测N2a细胞轴突相关基因表达及N2a细胞的糖原染色;Western Bolt检测SC-like cell MVs刺激N2a、PC12细胞株后的蛋白水平表达情况。研究结果:(1)SC-like cells可以由h ESC-NSCs诱导分化而来,具有传统施万细胞相似的形态,并且高表达施万细胞相关标志S100β、GFAP、HNK-1等基因。(2)SC-like cell MVs明显促进了背根神经节神经元轴突的生长。(3)大鼠坐骨神经横断性损伤模型成功构建并具有可行性。神经损伤后修复6周,SC-like cell MVs组受损侧后肢形态功能学恢复和轴突再生长度都较PBS组明显。(4)SC-like cell MVs可被N2a细胞吞噬,并促进其GAP43 m RNA的表达、突起生长和糖原生成;SC-like cell MVs通过PTEN/PI3K/Akt级联信号通路促进N2a、PC12细胞轴突生长,并伴随着一定的浓度依赖性。结论:(1)SC-like cells可以由h ESC-NSCs分化而来,并表达神经胶质细胞SCs标志。(2)SC-like cell MVs促进轴突的生长和糖原生成,可通过PTEN/PI3K/Akt级联信号通路促进神经元GAP43蛋白的表达,并且GAP43蛋白的表达对SC-like cell MVs浓度具有依赖性。(3)SC-like cell MVs对坐骨神经横断性损伤具有修复作用。