论文部分内容阅读
过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome Proliferator-activated Receptor gamma,PPARG)是目前发现在脂肪组织中调控脂肪酸代谢的核心转录因子,它能调控脂肪酸代谢基因网络,影响甘油三酯的合成,是脂肪细胞脂肪酸沉积的关键因子。但目前山羊泌乳过程中PPARG对乳腺脂肪酸代谢的机理研究却比较稀少。本研究以奶山羊乳腺上皮细胞为材料,利用5种不同的长链脂肪酸(C16,C18,CLA,DHA和EPA),PPARG的激动剂(ROSI)和抑制剂(GW)处理山羊乳腺上皮细胞,以及结合超表达PPARG具体分析了PPARG对脂肪酸代谢相关基因的表达调控,同时分析了PPARG的靶基因Adipo R1和LPL基因在山羊乳腺上皮细胞中的功能,获得以下结果:1.利用50μM GW(PPARG的抑制剂)处理山羊乳腺上皮细胞后发现,Adipo R1,LPIN1,PPARG,LXRA,LPL,ACSL1,FABP3和FABP4等基因m RNA表达下调;利用50μM ROSI(PPARG的激动剂)处理乳腺上皮细胞后发现,Adipo R1,FADS1,AGPAT6,LPIN1,SCD,FABP3,LPL,FABP4和SREBF2等基因的m RNA表达上调。饱和长链脂肪酸(C16和C18)比ROSI的效应更强,能够明显上调大部分检测的基因,而CLA却极大的下调了FASN,FADS1,LPIN1,SREBF1,SREBF2,INSIG1,RXRA,NCOR1和FABP3基因的表达(P<0.05)。同时研究发现,GW和饱和脂肪酸共同处理细胞没有完全消除饱和脂肪酸对脂代谢基因的作用,而GW和不饱和长链脂肪酸(CLA,DHA和EPA)共同处理后对脂代谢基因作用复杂。2.在奶山羊乳腺上皮细胞中感染腺病毒介导的PPARG超表达载体后发现,ACSS2,ACSL1,LPL,SCD,DGAT1,FADS1,GPAM和LPIN1等脂肪酸代谢相关基因和Adipo R1,LXRA,MLXIPL,PPARG和PPARGC1B等转录因子以及CRY1和CRY2等生物钟网络组分相关基因表达上调(P<0.05)。之后利用ROSI处理携带PPARG超表达载体的细胞后发现,与ROSI未处理组相比LPL,ACSS2,GPAM,LPIN1,SCD,Adipo R1,LXRA,PPARG,PPARGC1B,CRY1和CRY2表达显著增强(P<0.05)。总结以上结果确定,Adipo R1和LPL基因是山羊乳腺上皮细胞中PPARG下游的2个重要的靶基因。3.克隆山羊乳腺组织中Adipo R1基因分析发现,Adipo R1全长2 032 bp,编码375个氨基酸;其氨基酸序列包含7个跨膜结构域,并且整个序列中不含信号肽;该基因在肺中的表达量最高,小肠和乳腺次之,在心脏中表达量最低;同时发现,乳腺组织Adipo R1的表达量在泌乳盛期显著高于干奶期(P<0.05)。Adipo R1对胰岛素和催乳素具有剂量依赖性,并受到二者的影响。本研究用不同浓度的胰岛素(1 nmol/L,50 nmol/L和100 nmol/L)处理乳腺上皮细胞后发现,Adipo R1的表达量下调,尤其是50n M胰岛素处理时效果最明显(P<0.01);用不同浓度的催乳素(10 ng/m L,100 ng/m L和1000 ng/m L)处理乳腺上皮细胞后发现,Adipo R1的表达量上升,在浓度为100 ng/m L时作用效果最明显(P<0.05)。同时研究发现,乳腺上皮细胞中Adipo R1被干扰后,SREBF1,ACACA,FASN,SCD等脂肪酸从头合成的基因表达显著下调、与甘油三脂水解相关的基因ATGL和HSL m RNA表达显著下调(P<0.05)。4.克隆山羊乳腺组织中LPL基因分析发现,LPL c DNA全长为3555bp核苷酸,编码478个氨基酸,LPL的氨基酸序列中不存在跨膜区域,信号肽区域在第23-24个氨基酸处。该基因在脂肪组织中的表达最高,在心脏和乳腺组织中表达次之,在肝脏和肌肉中表达最低。同时发现,LPL的表达从干奶期到泌乳初期显著上升,之后在泌乳盛期和中期下降,进入泌乳末期后再次上调,LPL在整个泌乳期的表达呈现出一个“N”型曲线。利用腺病毒介导的sh RNA干扰LPL后发现,SREBF1,FASN,LIPE和PPARG的m RNA表达下调,FFAR3的m RNA表达上调(P<0.05)。添加Orlistat(LPL的抑制剂)处理乳腺上皮细胞后发现,LIPE,FASN,ACACA和PPARG的m RNA表达下调,而FFAR3和SREBF1的m RNA表达上调(P<0.05)。本研究表明,PPARG通过其靶基因调控山羊乳腺细胞脂肪酸的从头合成,去饱和化,脂滴形成以及甘油三酯的合成等相关基因的表达,在奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢中发挥重要的调控作用。