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开花期在水稻(Oryza sativa)发育和产量形成过程中起到非常重要的作用。水稻开花期是内源因素和外界的环境条件相互作用、多基因参与的、复杂的生命过程。虽然,目前已经初步建立了 Heading date 1和Early heading date 1为关键调节因子的促进或抑制水稻开花的分子调控网络。但是,水稻开花期调控的分子机制还远不清楚。本项目借助生物信息学方法,利用拟南芥(Arabidopsis thaniala)中开花时间相关基因Flowering bHLHs(FBHs)基因家族的序列,筛选获得了水稻中的同源基因OsFBHs;利用CRISPR-Cas9基因编辑技术、DNA重组和水稻转基因技术,创制了OFBVHs基因超表达、下调表达或基因定点敲除的水稻或拟南芥转基因材料;经过对转基因株系的农艺性状观察,筛选获得了开花期等农艺性状发生变化的OsFBH1和OsFBH3基因的转基因株系。利用这些开花期改变的转基因株系为试材,采用荧光定量RT-PCR,酵母单(双)杂交,染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)等技术,本项目深入研究了OsFBH 的表达模式、亚细胞定位、调控开花期的靶基因;揭示了 OsFBHs调控水稻开花期的分子机制。为不同生育期的水稻品种改良,提高水稻的适应性、产量和品质提供理论依据。本项目的主要研究结果如下:1.水稻OsFBHs与拟南芥FBHs基因进化上保守,而且亲缘关系较近。拟南芥中FBHs基因家族有4个成员(包括:FBH1-4-),编码包含有HLH保守结构域的蛋白质。水稻中有4个FBHs的同源基因(OsFBH1-4)与拟南芥中的FBHs亲源关系较近。其中OsFBH1和OsFBH2与拟南芥的FBH1和FBH2的亲缘关系较近,OsFBH3和OsFBH4与拟南芥中的FBH3和FBH4的亲缘关系较近。2.OsFBH1的表达模式和亚细胞定位分析。荧光定量RT-PCR与GUS染色的结果表明,OsFBH1在水稻的叶片和叶鞘中表达水平较高,在根部和胚芽鞘组织中也有表达。OsFBH1的表达受生物钟的调控,其表达高峰出现在夜间。不同的生长发育时期,OsFBH1的表达水平不同。在播种后50天,OsFBH1出现表达高峰。激光共聚焦显微镜观察结果表明,OsFBH1所编码的蛋白质定位在细胞核中。3.超表达OsFBH1可以明显延迟拟南芥的开花时间。与野生型(wild-type,WT)相比,拟南芥OsFBH1超表达转基因株系的莲座叶数目显著增加,现蕾时间及第一朵花开放时间明显延迟。发育时期转换的试验结果表明,拟南芥OsFBH1的超表达转基因株系,使得拟南芥幼年叶和成年叶增加,延长了幼年营养生长期和成年营养生长期,从而延长了拟南芥从营养生长向生殖生长过渡的时间,最终引起拟南芥晚花。分子水平检测结果表明,OsFBH1表达上调,使促进拟南芥开花的关键基因,例如:Flowering Locus T(FT),Twin sister of FT,Suppressor of Overexpression of CONSTANS1(SOC1)的表达水平下调,从而延迟拟南芥开花。4.超表达OsFBH1可以明显的延迟水稻的开花期。与野生型(沈农9816,SN9816)相比,超表达OsFBH1水稻转基因株系开花期明显延迟。分子水平检测结果表明,OsFBH1表达上调,导致促进水稻开花的关键基因,例如:Heading Date 3a和Rice Flowering locus T1的表达水平明显降低,从而,延迟水稻开花时间。此外,超表达OsFBH1水稻转基因株系还表现为株高降低,水稻籽粒宽度变窄,分蘖数减少等多种生长发育异常的表型。5.超表达OsFBH3促进拟南芥开花。与WT相比,超表达OsFBH3拟南芥转基因株系表现为早花。莲座叶数目明显减少,现蕾时间和开花时间明显早于WT。发育时期转换的试验结果表明,OsFBH3没有影响幼年营养生长期向成年营养生长期的时期转换,主要是缩短了成年营养生长期,促进了营养生长向生殖生长的时期转换,进而导致拟南芥开花提前。RT-PCR的结果表明,在长日照和短日照条件下,拟南芥OsFBH3超表达转基因株系提高CONSTANS的表达。从而提高SOC1和FT的表达水平,促进了拟南芥开花。除了影响开花期外,超表达OsFBH3还导致拟南芥其它方面的生长发育异常,表现在株型变小,叶片和花变小,花苔变细,果荚变短,胚胎数目减少,败育胚胎数目增加等方面。6.OsFBH 的表达模式和亚细胞定位分析。荧光定量RT-PCR和GUS染色的研究结果表明,OsFBH3主要在水稻的叶片,叶鞘和茎干中表达;在不同时期OsFBH3的表达水平不同,在播种后50天左右,OsFBH3出现表达高峰。OsFBH3的表达受生物钟的调控,表达最高峰出现在夜间。激光共聚焦显微镜观察结果表明,OsFBH3所编码的蛋白质定位于细胞核。