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光合作用是地球上最重要的有机合成反应,直接或间接的为整个生物圈提供能量,其重要性毋庸置疑。进行光合作用研究,提高光合作用效率对于解决当前粮食危机、粮食安全、能源危机等都具有重要意义,同时也面临着巨大的挑战。 光合作用分为光反应和暗反应,研究人员针对光反应和暗反应采取不同的策略来提高光合作用效率。在光反应阶段,即能量转化方面,通过扩大光合作用的光谱范围、优化捕光复合体的结构来提高光合作用效率;在暗反应阶段,即CO2固定方面,通过分子工程改造RuBisco提高其针对CO2的催化效率或筛选更高固碳活性的RuBisco,或者将蓝藻的CCM机制转移到高等植物,降低或者重新设计光呼吸。 本研究以集胞藻6803为研究对象,开发了两种不同的提高光合作用效率的新策略。第一种策略是在集胞藻6803中引入NADPH还原力驱动提高光合作用效率。光合作用分为光反应和暗反应,二者并不是完全分离的。光反应阶段光能转变为ATP和NADPH形式的化学能,暗反应阶段通过Calvin cycle消耗ATP和NADPH将CO2还原成有机物。ATP和NADPH的再生与消耗成为连接光反应和暗反应的关键,光反应的线性电子传递链产生固定比例的2.57ATP/2NADPH,但是暗反应进行CO2固定需要3ATP/2NADPH,这说明光反应产生的ATP不能满足暗反应固定CO2的能量需求,这种光反应和暗反应的ATP供需不平衡可能是影响光合作用效率的因素之一。如果满足暗反应ATP的需求,光反应会产生3ATP/2.33NADPH,但是暗反应只能消耗2NADPH,这样就造成了NADPH的不平衡。因此我们假设加强NADPH消耗能够提高光合作用效率,根据这个假设我们在集胞藻6803中设计、创建了一条NADPH消耗的异丙醇合成途径。通过一系列生理生化分析,NADPH消耗菌的生物量显著增加(OD730、叶绿素、细胞干重等),固碳速率提高了38.5‰光合放氧速率提高了60%,光系统的光合效率Y和相对电子传递速率rETR均明显高于对照,证明在集胞藻6803中引入NADPH消耗明显提高了蓝藻的光合作用效率。 第二种策略是在集胞藻6803中同时引入ATP/NADPH消耗,替代光呼吸的光保护功能,实现对光呼吸的敲除,进而提高了光合作用效率。本章以光呼吸的保护机制-消耗过多的ATP和NADPH,避免光损伤为切入点,从细胞全局出发,引入ATP和NADPH消耗途径,探索减弱或消除光呼吸的新策略。通过对蓝藻代谢途径进行分析,发现MEP途径是高能耗途径,从丙酮酸到DMAPP的七步反应中,有六步反应需要能量或还原力,共消耗3个高能磷酸键和2个还原力。因此,对集胞藻6803中的MEP途径进行设计、改造,引入异戊二烯合酶(IspS),以MEP途径产生的DMAPP为底物生成异戊二烯以气体的形式释放出来,可以带走更多热量;同时避免底物积累抑制,可以使反应随时进行。从对高能化合物消耗和产物以气体形式释放、反应可以随时进行等特征来看,集胞藻6803中引入的异戊二烯合成途径-开放式的ATP和NADPH消耗能力,可以行使光呼吸消耗高能化合物、避免光损伤的生理功能。引入ATP和NADPH消耗敲除光呼吸菌ispS-glcD1/D2和MEP*-ispS-glcD1/D2能够在空气中生长且没有表现出高二氧化碳依赖的表型,发酵结果表明MEP*-ispS-glcD1/D2的异戊二烯产量达到了188.4μg/L,MEP*-ispS-glcD1/D2的光合放氧速率和光系统的光合效率Y和相对电子传递速率rETR均明显高于对照,证明在集胞藻6803中引入引入ATP和NADPH消耗敲除光呼吸明显提高了蓝藻的光合作用效率。 本研究在蓝藻中分别引入NADPH还原力驱动,同时引入ATP/NADPH消耗敲除光呼吸,开发了两种不同的提高光合作用效率的新策略,为高等植物光合作用研究提供了新思路。