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在真核生物中,DNA甲基化是调控基因表达的一个重要的表观遗传修饰。植物中,基因组在CG、CHG和CHH位点上都能发生DNA甲基化。DNA甲基化可以遗传到子代,调控生物体的基因表达、细胞分化、基因印记和胚胎发育等过程。大量研究表明, DNA甲基化通过建立、维持和去除以保持动态变化,调控DNA甲基化修饰的蛋白主要有建立DNA甲基化的DNA甲基转移酶、去除DNA甲基化的DNA去甲基化酶和帮助它们发挥功能的一些作用蛋白。此外,DNA甲基化的修饰还受到组蛋白修饰和染色体结构的影响。但是,关于DNA甲基化和去甲基化的上游调控因子的相关报道较少。自然界环境中存在的多种非生物胁迫,严重影响农作物的生长发育,是全球农作物减产的重要因素。虽然非生物胁迫的信号转导途径已经研究的比较深入,但是DNA甲基化和去甲基化修饰是否参与到这个调控过程中仍不十分清楚。DNA甲基化响应外界非生物胁迫的作用机理也需要进一步阐明。本研究主要对响应ABA信号的SAG(Sensitive to ABA during Germination)如何参与DNA甲基化调控进行了探索。主要结果如下: (1)CHOP-PCR法筛选到响应逆境胁迫的DNA甲基化调控因子。采用CHOP-PCR技术对响应逆境胁迫的拟南芥突变体进行了筛选。发现SAG的T-DNA插入突变体(sag)在DT-77(At1G26400启动子区)位点的DNA甲基化程度显著提高。 (2)利用重亚硫酸盐测序(BSP)技术证明SAG的T-DNA(sag)插入突变体DT-77位点的DNA呈现高甲基化状态。 (3)启动子序列分析发现AtSAG启动子区含有LTR等胁迫和激素顺式作用元件。SAG基因编码一个AtPDS蛋白家族的功能蛋白。SAG的mRNA全长包含2622个碱基,编码一条873个氨基酸的多肽链。预测其C端602位至658位氨基酸编码LBR-Tudor结构域,SAG中LBR-Tudor结构域高度保守。 (4)利用SAG自身启动子的互补株系可以互补sag突变体的表型。 (5)sag突变体中DNA去甲基化酶基因 ROS1表达量显著下调。利用qRT-PCR对DNA甲基化调控基因的表达量分析发现,DNA去甲基化酶基因ROS1转录水平的降低,与基因组DNA甲基化程度提高相对应。 (6)SAG蛋白定位于内质网。转化 SAG-GFP融合蛋白表达质粒的拟南芥植株,在共聚焦显微镜下,内质网上可观察到GFP荧光。 (7)SAG蛋白与ADP1互作。为探究蛋白如何行使功能,我们筛选可能与SAG互作的蛋白。通过分析SAG免疫共沉淀液相色谱串联质谱分析数据,我们发现132个蛋白可能和SAG互作。利用酵母双杂交实验,证明SAG与ADP1互作。