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目前,探讨COX在胃粘膜炎症中的作用主要是通过对NSAIDs的研究实现的.因此,该研究利用Hp感染的野生型和COX基因敲除小鼠模型,在Hp诱导慢性胃炎过程中COX-1和COX-2对胃粘膜的炎症程度、胃上皮细胞的凋亡和增殖、细胞因子的表达以及PGE<,2>、LTB<,4>和LTC<,4>生成等方面的作用进行了较为系统的探索.材料和方法一.幽门螺杆菌感染环氧合酶基因敲除小鼠模型的建立及评价1.实验动物及其基因鉴定本研究所采用的COX基因敲除小鼠是COX-1基因敲除小鼠的杂合子(COX-1+/-)、纯合子(COX-1-/-)和COX-2基因敲除小鼠的杂合子(COX-2+/-)、纯合子(COX-2-/-)以及相同种属的野生型(WT)小鼠.通过提取尾组织DNA,用PCR方法进行基因表型的鉴定.2.实验动物分组及处理经鉴定后的小鼠随机分为Hp感染的WT组、COX-1+/-组、COX-1-/-组、COX-2+/-组和COX-2-/-组以及相应的对照组.用Hp TN2菌株灌胃动物;对照组给予相同量的布氏肉汤.在Hp接种24周后处死动物,取胃组织进行各指标的检测.3.定量细菌培养鼠胃称重后匀浆.匀浆液经1O和100倍稀释后,分别取1OOμl接种于改良Skirrow选择性琼脂平板上,于37℃微需氧条件下培养5~7天,计数Hp菌落数.Hp定植密度(CFUs/g组织)=Hp菌落数×稀释度/胃重量.4.胃组织COX蛋白表达的检测(免疫印迹法)小鼠胃组织经匀浆后离心.取上清,测定其蛋白浓度.将含蛋白50μg的每个样品进行SDS-PAGE电泳.分离凝胶,用转移缓冲液浸泡后,与PVDF膜对齐、贴紧,在电转移仪中92 mA电转3 hr.取出硝酸纤维素膜,用含5％脱脂牛奶的TBST室温下封闭1 hr后,加入一抗(1:100)室温下孵育1 hr.经TBST洗涤后,再加二抗(1:3000),室温下孵育1 hr,膜再经TBST洗涤后,用ECL化学发光检测系统检测.5.组织学检查将胃组织以10%的中性福尔马林固定及石蜡包埋后切片,做常规H&E和改良Giemsa染色.按新悉尼系统标准中的淋巴细胞和粒单细胞的浸润程度对胃炎做分级评分.通过改良Giemsa染色观察Hp的定植情况.二.环氧合酶基因敲除对幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞凋亡和增殖及炎症介质生成的影响1.胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖的检测根据试剂盒的说明,用原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测胃上皮细胞的凋亡.用免疫组织化学法检测Ki-67的表达来观察胃上皮细胞的增殖情况.2.胃组织细胞因子的半定量RT-PCR检测提取胃粘膜组织总RNA,然后将RNA反转录成cDNA.取2μl cDNA进行PCR扩增.PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,并拍照和分析结果.采用β-actin作为半定量内参照,计算各细胞因子mRNA的相对表达水平.3.胃粘膜组织PGE<,2>、LTB<,4>和LTC<,4>水平的ELISA检测胃组织经称重后,放入组织裂解液中进行匀浆,将匀浆液在冰浴下进行超声粉碎,再低温离心,留上清,根据试剂盒的要求进行操作.结论1.COX-1和COX-2基因敲除对Hp在小鼠胃粘膜的定植水平无明显影响.2.COX-1和COX-2基因敲除都加重了小鼠Hp相关性胃炎炎症的程度,这种作用可能主要是通过上调促炎细胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α的表达实现的.3.COX-2基因敲除可使Hp感染所致的小鼠胃上皮细胞的增殖减少,而对凋亡无明显影响,表明COX-2基因敲除提高了Hp感染引起的凋亡与增殖之间的比率,这种作用可能在减少Hp诱导胃癌的形成中起一定的作用.4.无论有无Hp感染,COX-1基因敲除使小鼠胃粘膜PGE<,2>生成明显减少,且在无Hp感染时未引起明显的胃粘膜病变,提示在无损害因素的前提下,单一的缺少PGE<,2>不会对胃粘膜的正常结构造成损害.5.Hp感染使野生型和COX基因敲除小鼠胃组织LTB<,4>和LTC<,4>的生成都明显增加,但在后者未见进一步增加,表明LTB<,4>和LTC<,4>虽参与了Hp相关性胃炎的形成,但与COX基因敲除小鼠胃炎的加重无关.第2部分重组减毒沙门疫苗菌对幽门螺杆菌感染防治的动物实验研究研究背景和目的幽门螺杆菌的致病是个复杂的多步骤多因素过程.Hp诱导的特异性抗体和细胞免疫不能有效地清除细菌,反而可导致胃粘膜免疫病理损害.有效的预防和治疗Hp感染的方法将有可能大幅度降低上述消化道疾病的发病率.目前常用的联合化学药物治疗虽然有高达90%的Hp根除率,但有一定的副反应、价格昂贵、抗生素耐药率逐年增高及病人的依从性差等缺点.采用人体可很好耐受、效高价廉的Hp疫苗预防和治疗Hp感染是一个较为理想的方法,具有很好的社会和经济效益.方法1.重组减毒沙门疫苗菌的免疫和治疗免疫方法:将Ⅱ级C57BL/6小鼠随机分生理盐水组、PBS组、减毒鼠伤寒沙门菌SL3261组、重组减毒鼠伤寒沙门菌pTrc99A-ureB+pGSTag-katA组、重组减毒鼠伤寒沙门菌pTrc99A-ureB+pTrc99A-hpaA组及重组减毒鼠伤寒沙门菌pTrc99A-ureB+pGSTag-katA+pTrc99A-hpaA组,共6组,每组10~12只.通过灌胃方法进行口服免疫.免疫4周后,再通过灌胃方法每只小鼠(生理盐水组除外)均用活力良好的Hp菌株攻击2次(1×10<7>CFU/只),每日1次.再4周后处死所有小鼠.治疗方法:将Ⅱ级C57BL/6小鼠随机分为重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位疫苗组、过氧化氢酶疫苗组和生理盐水组3组,每组1O只.通过灌胃方法每只小鼠均用活力良好的Hp菌株攻击2次(1×10<7>CFU/只),隔日1次.在攻击后的4周,相应组分别给予予重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位疫苗(1×10<7>CFU/只)、重组减毒沙门菌过氧化氢酶疫苗(1×10<7>CFU/只)灌胃治疗及生理盐水灌胃(对照组).治疗后4周处死所有小鼠.2.鼠胃幽门螺杆菌检查小鼠经处死后,取出胃纵行切为两半.其中一半作定量细菌培养;另一半再纵行一分为二,一半用于快速尿素酶试验,另一半用中性福尔马林固定,用石蜡包埋后切片行改良Giemsa染色和H&E染色,分别用于观察Hp定植和粘膜炎症情况.3.定量培养细菌将一半鼠胃称重后匀浆,再将匀浆作1:10、1:100、1:1000系列倍比稀释,取每一稀释度匀浆100μl接种于改良Skirrow选择性琼脂平板上,于37℃微需氧条件下培养3天,计数Hp菌落数.4.抗原特异性淋巴细胞增殖反应的测定处死小鼠后,取脾制备细胞悬液.调整细胞浓度,并按四甲基偶氮唑盐(MTT)法完成相关步骤.增殖指数=实验组OD值/对照组OD值.结论1.口服表达Hp-ureB、katA和hpaA的多组分重组减毒沙门疫苗菌对小鼠Hp感染具有一定免疫保护作用,但不能完全预防感染,需进一步筛选更为有效的抗原,构建更为合理的多组分重组减毒沙门疫苗菌.2.口服表达Hp-ureB和katA的重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株对Hp感染的小鼠均有较好治疗作用,可明显减少其胃内Hp的定植水平.