禽流感(Avian influenza, AI)是由禽流感病毒引起禽类神经系统、呼吸系统、消化系统乃至全身性感染,甚至死亡的一种烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物传染病。2003年,高致病禽流感(Highly pathogenic avian influenza, HPAI)的爆发出现于东南亚的一些国家。HPAIV H5N1在欧洲、亚洲以及非洲的频频爆发已经导致了数以万计禽类的死亡,给养殖业带来了不可估计的损失。AIV的难以控制也让人们越发担心新型禽流感病毒会在人与人之间传播,而大多数人感染HPAIV的病例均有与病死禽接触的历史。人们通常通过大面积的扑杀病禽来控制疫情,但事实证明,HPAI快速的传播速度决定了扑杀并不能从根本上消灭病毒,因此在高危地区进行预防性疫苗接种已经成为当今最有效手段之一。目前,已经有许多种类的疫苗被研制成功,包括基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗、灭活疫苗等,它们都具有较好的免疫保护作用以及安全性,但也有各自的局限性。新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)像AIV一样,可以在禽类中广泛传播并引起高致死率。新城疫病毒属副粘病毒科(Paramyxoviridae),副粘病毒属。NDV是不分节段的单股负链RNA病毒,其基因组全长约15Kb,整个基因组主要由NP, M, F, HN以及RNA依赖性RNA聚合酶L蛋白构成。很多国家对NDV的免疫防治是强制性的。目前,NDV作为一种新型的疫苗载体得到高度的关注。这种活载体具有其独特的优点。首先,我们可以通过极其方便的血清学手段鉴别免疫和未免疫动物,并且可以检测免疫动物血清中HI抗体滴度评价免疫效果。其次,重组的NDV可以通过滴鼻点眼或者是饮水的途径进行免疫,使用方便。这种方式很适合养殖场的大规模接种。为了提高疫苗对疫病防控的效果,研究者一直不断探索新型疫苗的研发。密码子优化作为提高疫苗效率的可能手段之一也被许多学者提出并加以研究。在本研究中,我们利用已经建立的NDV rLaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,分别构建表达H5N1亚型禽流感病毒裂解位点突变型HA蛋白和密码子优化的HA蛋白的重组病毒,命名为rL-H5HAmut和rL-optiH5HA=在病毒拯救成功后,我们对已经拯救的病毒进行间接免疫荧光和western blot试验,已验证外源蛋白的正确表达。结果表明,两个重组病毒均可以在BHK-21细胞以及鸡胚成纤维细胞(CEF)中高效地表达HA蛋白。SPF鸡的免疫试验结果显示,在初次免疫后,两者均可在第一周检测到NDVHI抗体。在免疫后的第三周NDV抗体滴度达到最高值,第四周略有下降。在初次免疫的第二周开始检测到流感HA抗体,且在第四周达到最高值。相比较而言,rL-optiH5HA从第一周到第四周,都比rL-H5HAmut产生了更高的NDV抗体和流感H5N1HA抗体的滴度。二次免疫后,免疫鸡体内NDV和流感H5N1HA抗体快速上升,并且优化的重组病毒诱导产生的抗体滴度高于未优化的重组病毒。研究结果表明,经过密码子优化的NDV重组病毒具有明显的免疫增强作用,具有推广应用的巨大潜力。